2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden
Summary
We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.
Abstract
Primaire trilharen (PC) zijn niet-beweeglijke dynamische op microtubuli gebaseerde organellen die uitsteken uit het oppervlak van de meeste zoogdiercellen. Ze komen uit de oudere centriole tijdens de G1 / G0-fase van de celcyclus, terwijl ze uiteenvallen als de cellen opnieuw de celcyclus binnenkomen op de G2 / M-fasegrens. Ze functioneren als signaalhubs, door extracellulaire signalen te detecteren en te transduceren die cruciaal zijn voor veel celprocessen. Net als bij de meeste celtypen is aangetoond dat alle neocorticale neurale stam- en voorlopercellen (NSPC’s) een PC herbergen waardoor ze specifieke signalen kunnen waarnemen en transduceren die nodig zijn voor de normale cerebrale corticale ontwikkeling. Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor het genereren en karakteriseren van tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) celgebaseerde modellen van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hIPSCs) om de betrokkenheid van PC tijdens neocorticale ontwikkeling verder te ontleden. In het bijzonder presenteren we protocollen om de PC-biogenese en -functie in 2D neurale rozet-afgeleide NSPC’s te bestuderen, inclusief de transductie van de Sonic Hedgehog (SHH) -route. Om te profiteren van de driedimensionale (3D) organisatie van cerebrale organoïden, beschrijven we een eenvoudige methode voor 3D-beeldvorming van in toto immunostained cerebrale organoïden. Na optische clearing maakt snelle acquisitie van volledige organoïden detectie van zowel centrosomen als PC op neocorticale voorlopers en neuronen van de hele organoïde mogelijk. Ten slotte beschrijven we de procedure voor immunostaining en clearing van dikke vrij zwevende organoïde secties die een aanzienlijke mate van 3D ruimtelijke informatie behouden en de hoge resolutie acquisitie mogelijk maken die nodig is voor de gedetailleerde kwalitatieve en kwantitatieve analyse van PC-biogenese en -functie.
Introduction
Primaire trilharen (PC) zijn op microtubuli gebaseerde organellen die een overvloed aan chemische en mechanische signalen uit de extracellulaire omgeving waarnemen en transduceren. In het bijzonder is PC het centrale organel voor de transductie van de egelsignaleringsroute bij gewervelde dieren1,2. Hoewel de meeste neurale cellen al lang een PC herbergen, is de bijdrage van dit organel aan het vormgeven van het centrale zenuwstelsel lang ondergewaardeerd. Studies naar neocorticale ontwikkeling hebben geleid tot de ontdekking van meerdere neurale stam- en voorlopercellen (NSPC’s), die allemaal een PC herbergen, waarvan de locatie is voorgesteld als cruciaal voor de bepaling van het lot van de voorloper3,4,5,6,7. Pc is cruciaal gebleken voor celmechanismen die nodig zijn voor normale cerebrale corticale ontwikkeling, waaronder NSPC-expansie en commitment8,9,10,11,12, evenals apicobasale polariteit van radiale gliale scaffold die neuronale migratie ondersteunt13. Bovendien is PC vereist tijdens interneuronen tangentiële migratie naar de corticale plaat14,15. Ten slotte is een rol voor de PC voorgesteld bij het tot stand brengen van synaptische verbindingen van neuronen in de hersenschors16,17. Al met al pleiten deze bevindingen voor een cruciale rol van PC bij belangrijke stappen van cerebrale corticale ontwikkeling18,19 en verhogen ze de noodzaak om hun betrokkenheid bij de pathologische mechanismen die ten grondslag liggen aan anomalieën van cerebrale corticale ontwikkeling te onderzoeken.
Recente studies hebben ons begrip van belangrijke cellulaire en moleculaire verschillen tussen corticale ontwikkeling in menselijke en dierlijke modellen grotendeels verbeterd, met de nadruk op de noodzaak om menselijke modelsystemen te ontwikkelen. In deze visie vertegenwoordigen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hIPSCs) een veelbelovende benadering om ziektepathogenese te bestuderen in een relevante genetische en cellulaire context. Adherenante tweedimensionale (2D) celgebaseerde modellen of neurale rozetten bevatten NSPC’s die vergelijkbaar zijn met die in de zich ontwikkelende hersenschors, die worden georganiseerd in rozetvormige structuren met de juiste apicobasale polariteit20,21,22. Bovendien maakt het driedimensionale (3D) kweeksysteem de generatie van dorsale voorhersenenorganoïden mogelijk die veel kenmerken van de menselijke cerebrale corticale ontwikkeling samenvatten23,24,25,26. Die twee complementaire celgebaseerde modelleringsbenaderingen bieden opwindende perspectieven om de betrokkenheid van PC tijdens de normale en pathologische ontwikkeling van de hersenschors te ontleden.
Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor het genereren en karakteriseren van neurale rozetten en afgeleide NSPC’s en dorsale voorhersenenorganoïden. We bieden ook gedetailleerde protocollen om de biogenese en functie van PC aanwezig op NSPC’s te analyseren door de transductie van de Sonic Hedgehog-route te testen en de dynamiek van cruciale moleculen die betrokken zijn bij deze route te analyseren. Om te profiteren van de 3D-organisatie van de cerebrale organoïden, hebben we ook een eenvoudige en kosteneffectieve methode opgezet voor 3D-beeldvorming van in toto immunostained cerebrale organoïden die snelle acquisitie mogelijk maken, dankzij een lichtbladmicroscoop, van de hele organoïde, met hoge resolutie waardoor PC kan worden gevisualiseerd op alle soorten neocorticale voorlopers en neuronen van de hele organoïde. Ten slotte hebben we de immunohistochemie aangepast op 150 μm vrij zwevende secties met daaropvolgende clearing en acquisitie met behulp van resonant scanning confocale microscoop die beeldacquisitie met hoge resolutie mogelijk maakt, wat nodig is voor de gedetailleerde analyse van PC-biogenese en -functie. In het bijzonder maakt 3D-beeldvormingssoftware 3D-reconstructie van pc mogelijk met daaropvolgende analyse van morfologische parameters, waaronder lengte, aantal en oriëntatie van pc, evenals signaalintensiteitsmeting van ciliaire componenten langs het axoneme.
Protocol
Representative Results
Discussion
PC worden nu beschouwd als belangrijke organellen die cruciale stappen reguleren tijdens de normale cerebrale corticale ontwikkeling18,19,31 inclusief NSPC-expansie en commitment8,9,10,11,12, evenals neuronale migratie13,14<sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Agence Nationale de la Recherche (ANR) aan S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) en N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 en ANR-19-CE16-0002-01). LB wordt ondersteund door de ANR in het kader van het Investissements d’avenir-programma (ANR-10-IAHU-01) en de Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-programma). Het Imagine Institute wordt ondersteund door overheidsfinanciering van de ANR in het kader van het Investissements d’avenir-programma (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-projecten) en als onderdeel van het tweede Investissements d’Avenir-programma (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
Riferimenti
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Biologia dello sviluppo. 370 (1), 33-41 (2012).
- Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution – from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
- Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
- Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
- Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
- Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
- Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
- Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
- Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
- Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
- Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
- Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
- Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2′-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).
