2 डी और 3 डी मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-आधारित मॉडल नियोकॉर्टिकल विकास के दौरान प्राथमिक सिलियम भागीदारी को विच्छेदित करने के लिए
Summary
हम 2 डी और 3 डी मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) के उत्पादन और लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं- नियोकॉर्टिकल विकास के मॉडल के साथ-साथ पूरक तरीके जो प्राथमिक सिलियम (पीसी) बायोजेनेसिस और फ़ंक्शन के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम करते हैं।
Abstract
प्राथमिक सिलिया (पीसी) गैर-गतिशील गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं-आधारित ऑर्गेनेल हैं जो अधिकांश स्तनधारी कोशिकाओं की सतह से निकलते हैं। वे सेल चक्र के जी 1 / जी 0 चरण के दौरान पुराने सेंट्रिओल से उभरते हैं, जबकि वे अलग हो जाते हैं क्योंकि कोशिकाएं जी 2 / एम चरण सीमा पर सेल चक्र में फिर से प्रवेश करती हैं। वे कई सेल प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण बाह्य कोशिकीय संकेतों का पता लगाने और ट्रांसड्यूसिंग करके सिग्नल हब के रूप में कार्य करते हैं। अधिकांश सेल प्रकारों के समान, सभी नियोकॉर्टिकल न्यूरल स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एनएसपीसी) को एक पीसी को आश्रय देते हुए दिखाया गया है जो उन्हें सामान्य सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास के लिए आवश्यक विशिष्ट संकेतों को समझने और ट्रांसड्यूस करने की अनुमति देता है। यहां, हम नियोकोर्टिकल विकास के दौरान पीसी की भागीदारी को और अधिक विच्छेदन करने के लिए मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) से दो आयामी (2 डी) और तीन-आयामी (3 डी) सेल-आधारित मॉडल उत्पन्न करने और चिह्नित करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, हम पीसी बायोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और 2 डी न्यूरल रोसेट-व्युत्पन्न एनएसपीसी में कार्य करते हैं, जिसमें सोनिक हेजहोग (एसएचएच) मार्ग का ट्रांसडक्शन शामिल है। सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के तीन आयामी (3 डी) संगठन का लाभ उठाने के लिए, हम टोटो इम्युनोस्टेन्ड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स में 3 डी इमेजिंग के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। ऑप्टिकल समाशोधन के बाद, पूरे ऑर्गेनोइड्स का तेजी से अधिग्रहण नियोकोर्टिकल पूर्वजों और पूरे ऑर्गेनोइड के न्यूरॉन्स पर सेंट्रोसोम और पीसी दोनों का पता लगाने की अनुमति देता है। अंत में, हम 3 डी स्थानिक जानकारी की एक महत्वपूर्ण डिग्री को संरक्षित करने और पीसी बायोजेनेसिस और फ़ंक्शन के विस्तृत गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक उच्च-रिज़ॉल्यूशन अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए मोटी मुक्त-फ्लोटिंग ऑर्गेनोइड वर्गों के इम्युनोस्टेनिंग और समाशोधन के लिए प्रक्रिया का विस्तार करते हैं।
Introduction
प्राथमिक सिलिया (पीसी) सूक्ष्मनलिकाएं-आधारित ऑर्गेनेल हैं जो बाह्य कोशिकीय वातावरण से रासायनिक और यांत्रिक संकेतों की अधिकता को समझते हैं और ट्रांसड्यूस करते हैं। विशेष रूप से, पीसी कशेरुकी 1,2 में हेजहोग सिग्नलिंग मार्ग के ट्रांसडक्शन के लिए केंद्रीय ऑर्गेनेल है। जबकि अधिकांश तंत्रिका कोशिकाओं को लंबे समय से एक पीसी को आश्रय देते हुए दिखाया गया है, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को आकार देने में इस ऑर्गेनेल के योगदान को लंबे समय से कम आंका गया है। नियोकॉर्टिकल विकास पर अध्ययन ने कई तंत्रिका स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एनएसपीसी) की खोज का नेतृत्व किया है, जो सभी एक पीसी को आश्रय देते हैं, जिसका स्थान पूर्वज भाग्य निर्धारण 3,4,5,6,7 के लिए महत्वपूर्ण होने का प्रस्ताव दिया गया है। पीसी को सेल तंत्र के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है जो सामान्य सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास के लिए आवश्यक हैं, जिसमें एनएसपीसी विस्तार और प्रतिबद्धता 8,9,10,11,12 के साथ-साथ रेडियल ग्लियाल पाड़ की एपिकोबेसल ध्रुवीयता भी शामिल है जो न्यूरोनल माइग्रेशन 13 का समर्थन करती है। इसके अलावा, पीसी cortical plate14,15 के लिए interneurons स्पर्शरेखा प्रवास के दौरान आवश्यक हैं। अंत में, पीसी के लिए एक भूमिका सेरेब्रल कॉर्टेक्स 16,17 में न्यूरॉन्स के सिनैप्टिक कनेक्शन की स्थापना में प्रस्तावित की गई है। कुल मिलाकर, ये निष्कर्ष सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास 18,19 के प्रमुख चरणों में पीसी की एक महत्वपूर्ण भूमिका के लिए तर्क देते हैं और सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास की विसंगतियों को अंतर्निहित रोग तंत्र में उनकी भागीदारी की जांच करने की आवश्यकता को बढ़ाते हैं।
हाल के अध्ययनों ने मानव और पशु मॉडल में कॉर्टिकल विकास के बीच महत्वपूर्ण सेलुलर और आणविक अंतरों की हमारी समझ में काफी हद तक सुधार किया है, मानव मॉडल सिस्टम विकसित करने की आवश्यकता पर जोर दिया है। इस दृष्टिकोण में, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) एक प्रासंगिक आनुवंशिक और सेलुलर संदर्भ में रोग रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। अनुयायी दो आयामी (2 डी) सेल-आधारित मॉडल या तंत्रिका रोसेट में विकासशील सेरेब्रल कॉर्टेक्स में देखे गए लोगों के समान एनएसपीसी होते हैं, जो रोसेट के आकार की संरचनाओं में व्यवस्थित हो जाते हैं जो सही एपिकोबेसल ध्रुवीयता 20,21,22 दिखाते हैं। इसके अलावा, तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणाली पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी की अनुमति देती है जो मानव सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास की कई विशेषताओं को दोहराती है23,24,25,26। उन दो पूरक सेल-आधारित मॉडलिंग दृष्टिकोण सेरेब्रल कॉर्टेक्स के सामान्य और रोग विकास के दौरान पीसी की भागीदारी को विच्छेदित करने के लिए रोमांचक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।
यहां, हम तंत्रिका रोसेट और व्युत्पन्न एनएसपीसी के साथ-साथ पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी और लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम सोनिक हेजहोग मार्ग के ट्रांसडक्शन का परीक्षण करके और इस मार्ग में शामिल महत्वपूर्ण अणुओं की गतिशीलता का विश्लेषण करके एनएसपीसी पर मौजूद पीसी के बायोजेनेसिस और कार्य का विश्लेषण करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं। सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के 3 डी संगठन का लाभ उठाने के लिए, हमने 3 डी इमेजिंग के लिए एक सरल और लागत प्रभावी विधि भी स्थापित की है , जो तेजी से अधिग्रहण की अनुमति देता है, एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप के लिए धन्यवाद, पूरे ऑर्गेनोइड के, उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ पूरे ऑर्गेनोइड के सभी प्रकार के नियोकॉर्टिकल पूर्वजों और न्यूरॉन्स पर पीसी की कल्पना करने में सक्षम बनाता है। अंत में, हमने 150 μm फ्री-फ्लोटिंग वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को अनुकूलित किया, जिसमें बाद में समाशोधन और अधिग्रहण का उपयोग करके अनुनादी स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि अधिग्रहण की अनुमति दी गई, जो पीसी बायोजेनेसिस और फ़ंक्शन के विस्तृत विश्लेषण के लिए आवश्यक है। विशेष रूप से, 3 डी-इमेजिंग सॉफ्टवेयर पीसी की लंबाई, संख्या और अभिविन्यास के साथ-साथ एक्सोनेम के साथ सिलिअरी घटकों के सिग्नल तीव्रता माप सहित रूपात्मक मापदंडों के बाद के विश्लेषण के साथ पीसी के 3 डी-पुनर्निर्माण की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पीसी को अब सामान्य सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास के दौरान महत्वपूर्ण चरणों को विनियमित करने वाले प्रमुख ऑर्गेनेल के रूप में माना जाता है18,19,31 एनएसपीसी विस्तार और प्रतिबद्धता<sup class="xr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को Agence Nationale de la Recherche (ANR) से S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) और N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 और ANR-19-CE16-0002-01) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एलबी को एएनआर द्वारा Investissements d’avenir कार्यक्रम (ANR-10-IAHU-01) और Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD कार्यक्रम) के तहत समर्थित किया जाता है। इमेजिन इंस्टीट्यूट को इन्वेस्टिसमेंट्स डी’एवेनिर प्रोग्राम (एएनआर -10-आईएएचयू -01, क्रॉसलैब परियोजनाओं) के तहत एएनआर से राज्य वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया जाता है और दूसरे निवेश डी’एवेनिर कार्यक्रम (एएनआर -17-आरएचयूएस -0002) के हिस्से के रूप में।
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
Riferimenti
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