Detta är en metod för att isolera livmoder lymfoida celler från både gravida och icke-gravida möss. Denna metod kan användas för flera nedströms applikationer såsom FACS-fenotypning, cellsortering, funktionella analyser, RNA-seq och proteomik. Protokollet här visar hur man fenotyp grupp 1 livmoderns medfödda lymfoida celler efter flöde cytometri.
Beskrivs här är en enkel metod för att isolera och fenotyp mus grupp 1 livmoderns medfödda lymfoida celler (g1 uILCs) från enskilda gravida livmodern genom flöde cytometri. Protokollet beskriver hur man ställer in tids parning för att erhålla flera synkron dammar, den mekaniska och enzymatiska matsmältningen av den gravida livmodern, färgning av encelliga suspensioner och en FACS strategi för att fenotyp och diskriminera g1 uILCs. Även om denna metod oundvikligen förlorar rumslig information om cellulära distribution inom vävnaden, har protokollet framgångsrikt tillämpats för att fastställa uILC heterogenitet, deras svar på moderns och fostrets faktorer som påverkar graviditeten, deras genuttryck profil och deras funktioner.
Beskrivs här är en enkel metod för att få ett högt utbyte av livmoderns medfödda lymfocyter från enskilda gravida livmodern. Denna metod bevarar proteinytan uttryck och funktionalitet av livmoderns medfödda lymfocyter och det är lämpligt för efterföljande tillämpningar såsom FACS fenomenotypning, RNAseq, proteomik eller funktionella analyser. Här ligger fokus på fenotypning av grupp 1 uILCs efter flödescytometri.
Livmodern består av tre lager: livmoderslemhinnan, myometrium och bukhinnan (figur 1). Endometrium är slemhinnan, som fodrar livmoderns lumen. Progesteron, som produceras av corpus luteum, omvandlar endometrium till decidua. Myometrium består av två lager av glatt muskel som utgör livmoderväggen. Perimetrium är serosa som omsluter livmodern och förbinder den med bukhinnan genom det breda ligamentet som kallas mesometrium. I ett tvärsnitt av livmodern kallas den del som är motsatt till lumen mesometrialsidan, medan delen nära lumen kallas anti-mesometriesidan. En mängd olika moderns leukocyter fyller endometrium och decidua, inklusive flera typer av celler, där de medfödda immuncellerna representerar de allra flesta celler. Medfödda lymfoida celler (INC), makrofager, dendritiska celler (DC), liksom CD4 + och CD8 + T lymfocyter, reglerande T-celler (Tregs) och sällsynta B-celler, kan alla spela viktiga roller i regleringen av livmodermiljön under hela graviditeten1,2. ICS i livmodern finns inte bara i slemhinnan, men också i myometrium hos möss. Inklusive alla tre grupperna av IPC är livmodern verkligen det organ som är mest tätbefolkat av grupp 1 IBC. Med den strukturella omvandlingen av livmodervävnader under hela dräktigheten förändras också antalet och andelen livmoderns leukocyter (se figur 2A för ett exempel på variationer i andelen undergrupper i grupp 1 uILC)3,4.
När möss nämns i detta dokument avses C57BL/6-stammen av inavlade laboratoriemöss. Avlade möss (t.ex. NMRI-möss) används ofta i reproduktiv forskning på grund av deras höga reproduktionshastighet. Användningen av inavlade stammar är dock nödvändig för att generera konsekventa resultat, och immunologens favoritgenetiska bakgrund är C57BL/6, även känd som B6.
Cirka 30% av livmoderns leukocyter i B6-dammar vid mitten av dräktigheten är g1 uILCs, som definieras av flödescytometri som livskraftig CD45 + CD3-CD19-NK1.1 + NKp46 + celler (figur 2B): pro-angiogenic vävnad-resident NK (trNK), IFN-g producerar konventionella NK (cNK) och uILC14,5. Andelen uNK-celler är ännu högre hos människor och nådde cirka 70% under det första kvartalet6. Det finns fler likheter än skillnader mellan människa och mus uNK och uILC7,8. Även om det är viktigt att ha skillnaderna i åtanke, är det användbart att integrera information som finns tillgänglig om de två arterna. När man kombinerar information som erhållits från undersökning av uILC hos människor och laboratoriegnagare, är det uppenbart att NK-celler hjälper till med homeostatiska förändringar som är väsentliga för livmoderns biologi, inklusive underhåll av arteriell integritet9 och spiralartärombyggnad10, samt trophoblast invasion11,12. De spelar också specifika roller i försvaret mot patogener13,14. Hos möss och råttor ackumuleras NK-celler mellan de två muskelskikten i myometrium av dammar i en övergående struktur som kallas Mesometrial Lymphoid Aggregate of pregnancy (MLAp)15 (figur 1B), även känd tidigare som metrialkörteln, vars funktion ännu inte har upptäckts.
Beskrivs här är ett detaljerat protokoll av den metod som används i laboratoriet för att isolera lymfocyter från livmodern hos gravida möss med en kombination av mekanisk uppdelning och enzymatisk matsmältning. Eftersom hela livmodern används i metoden är lymfocyter isolerade från livmodern under graviditeten en blandning avciduella och myometrieceller. Ytterligare dissekering av decidua från livmoderväggen och dess MLAp är möjlig, och det har beskrivits före16. Metoden som beskrivs här utvecklades för att erhålla livmoderns lymfocyter samtidigt bevara protein ytan uttryck, cellulära funktionalitet och livskraft. Resultatet är en enda cell suspension med minimala kvarvarande cellulära skräp och en avkastning som vanligtvis sträcker sig från 1-5 miljoner celler vid mitten av dräktigheten (10,5 dagar) för en gravid livmoder. Tillämpningarna av denna metod omfattar fenotypning genom flödescytometri, cellsortering för efterföljande transkriptomiska eller proteomiska studier, funktionella studier såsom intracellulär cytokinproduktion, degranulering, ELISPOT eller cytotoxiska analyser. Protokollet som presenteras här fokuserar på att identifiera grupp 1 ICS men kan anpassas för andra celltyper som andra IPC, T-celler, B-celler, DC eller makrofager med mindre modifieringar av antikroppspanelen som används för FACS-analys. Protokollet kan också användas för att isolera celler från andra vävnader och för poolade icke-gravida uteri.
Metoden innehåller flera kritiska steg som diskuteras nedan. Det första kritiska steget är att få flera synkron graviditeter som den relativa frekvensen av leukocyt populationer förändras genom graviditet. Att ha flera dammar vid samma graviditetsdag möjliggör antingen biologiska upprepningar i samma experiment eller poolning av lymfocyter från enskilda dammar för att få större antal som krävs för nedströmsapplikationer. Tidsbeprövad parning gör det möjligt för forskaren att fastställa befruktning inom en 24-timmarsperiod. Även om möss lever i cirka 2,5 år, kommer de att vara i reproduktiv ålder från 4-7 veckor till 6-8 månader gammal. Eftersom yngre möss vanligtvis producerar mindre valpar, paras honmöss i allmänhet inte förrän de är mellan 6-8 veckor och manliga möss tills de är mellan 8-10 veckor. Med tanke på att estrus varar ca 15 h hos möss och förekommer var 4-5 dag, är den typiska parningshastigheten (avslöjad av en vaginal plugg, se figur 4) cirka 25%. Det är därför viktigt att använda möss i estrus och planera tillräckligt antal för att få det önskade antalet dammar för ett visst experiment. Estrus cykelfasen kan bestämmas av vaginalt utstrykscytologi22. Plugghastigheten kan förbättras genom att vila hanar 48 h före parning och genom att dra nytta av Whitten-effekten18. Alternativt kan man administrera gravid sto serum, som efterliknar effekten av det endogena follikelstimulerande hormonet, inducera oocyt mogna och, 42-50 h senare, mänskliga kolioniska gonadotropin, som efterliknar effekten av det endogena luteiniserande hormonet, inducera ägglossning. Denna hormonella behandling kringgår kravet på estrus och gör praktiskt taget alla behandlade kvinnor mottagliga.
Ett andra viktigt steg är att säkerställa kvaliteten på FACS-färgningen. Antikroppar som används i flödescytometri måste alltid titreras och användas vid optimal koncentration, och det är nödvändigt att kontrollera att den enzymatiska matsmältningen inte klyver viktiga antigena epitoper. För att bedöma om ett enzym kommer att klyva en epitop kan man färga två fraktioner av samma prov parallellt, en genomgår enzymatisk och den andra mekanisk matsmältning. På samma sätt är användningen av lämpliga kontroller och enskilda fläckar avgörande för att få tillförlitliga data. För sällsynta händelser kan pärlor användas för att generera enskilda fläckprover. Det rekommenderas att inte använda pärlor för att ställa in spänningar utan snarare en population av celler som innehåller lymfocyter och andra leukocyter, såsom splenocyter. Om pärlor används är det nödvändigt att titrera antikroppar för pärlfärgning, så fluorescensintensiteten hos färgade pärlor kommer att vara jämförbar med cellernas fluorescensintensitet. Vid svårigheter att separera positiva från negativa celler för en viss markör kan en FMO-kontroll också användas för att underlätta gating för en viss markör. När det gäller intracellulära markörer måste en isotypkontroll användas som intracellulär färgning kan leda till kvarvarande obundna antikroppar, som fortfarande kan finnas i cellerna efter tvättstegen och därmed öka bakgrundssignalen. Det rekommenderas att köra proverna inom 24 timmar efter fixering av cellerna för att uppnå bästa resultat vid fenotypning genom FACS-analys, eftersom autofluorescens ökar avsevärt med tiden och fluorescensintensiteten hos vissa antikroppar kan minska med tiden.
En annan viktig faktor att tänka på är nedströms tillämpningen av encellsavstängningen som erhållits med protokollet. För funktionella analyser är det viktigt att arbeta under sterila förhållanden. På samma sätt är det för efterföljande omicsstudier viktigt att arbeta i sterila och RNase, DNase och proteasfria.
Protokollet som presenteras här fokuserar på fenotypning grupp 1 ICS men kan anpassas för fenotypning av andra celltyper genom att modifiera antikroppspanelen. Det rekommenderas att alla antikroppar testas mot smält och icke-smält cell suspension för att upptäcka förlust/förändring av ytepitoper genom enzymatisk behandling. På samma sätt kan olika enzymer användas för att smälta vävnaden och öka cellutbytet, men dess effekt på viktiga antigena epitoper måste noggrant studeras. Medan NKp46 är en bra markör för mjälte NK-celler och fungerar i alla stammar av laboratoriemöss, är uttrycket av NKp46 på uNK-celler i C57BL/6 möss betydligt lägre än på mjälte NK-celler. Det är bäst att fläcka för både NK1.1 och NKp46 samtidigt. Om flera organ ska jämföras direkt rekommenderas att behandla alla prover lika, även om den enzymatiska matsmältningen inte krävs för vävnader som mjälte eller benmärg. Även om metoden som presenteras här är tillämplig på den icke-gravida livmodern, kommer lymfocytringen isolering av en tvåfas Percoll gradient att vara utmanande, och utbytet av isolerade celler kan vara för lågt för tillförlitlig FACS-analys och kommer därför att kräva sammanslagning av celler isolerade från livmodern hos enskilda, icke-gravida möss23.
Det finns begränsningar i protokollet att beakta för tolkningen av uppgifterna. Som det är fallet för alla vävnader kommer cirkulerande lymfocyter som kommer från blodet att isoleras tillsammans med vävnadsboende celler. Om uteslutandet av cirkulerande lymfocyter är avgörande för datatolkning kan intravital färgning utföras för att märka cirkulerande celler. Dessutom är en andra begränsning av protokollet att vissa celler kommer att gå förlorade eftersom inte alla celler kan extraheras från vävnaden. De vanligaste problemen och felsökningen av dem presenteras i tabell 2.
Historiskt sett har studien av celler i vävnader förlitat sig på histologisk undersökning av vävnadssektioner. Sandra Peels utmärkta recension24 sammanfattar det arbete som gjorts under mer än 100 år fram till slutet av 80-talet. Beskrivningar av celler som senare kallas uNK-celler förekommer faktiskt i manuskript publicerade mer än ett halvt sekel innan lymfocyter ens upptäcktes. Så, före upptäckten av NK celler i 1975, och uNK celler har anges som moderns glykogen celler eller granulerade metrial körtel celler. Anne Croy har gjort stora insatser inom området25 och vänligt lärt teamet den dissekering hon hade optimerat3, och det används för närvarande. Även om det är avgörande för att beskriva morfologi och vävnad plats uNK celler, klassisk histologiska undersökning är begränsad till detektion av endast ett fåtal markörer på cellerna av intresse. År 2008 beskrevs en flödescytometribaserad metod för att samtidigt detektera flera markörer på livmoderlymfocyter26. Detta är i huvudsak den metod som har beskrivits i detta dokument. Nyare tekniker som rumslig transkriptomik och avbildning genom massa cytometri kombinerar kraften i histologi och flöde-cytometri, vilket möjliggör både samtidig upptäckt av flera gener eller proteiner, respektive bevarandet av den normala vävnadsarkitekturen.
Tillämpningarna av den metod som beskrivs här är flera och inkluderar FACS-fenotypning, funktionell analys (såsom ELISPOT, degranulering eller cytotoxiska analyser), cellsortering och efterföljande transkriptomik eller proteomik. Ytterligare applikationer som kan utvecklas baserat på denna metod inkluderar odling och expansion av deciduella NK-celler efter cellsortering eller anrikning genom negativ utarmning. För närvarande finns det inget protokoll för att odla och expandera mus uNK-celler och bevara deras livskraft och funktionalitet under en längre period, på liknande sätt som mänskliga NK-celler som kan odlas och utökas i 7-14 dagar genom tillsats av IL-2 eller en kombination IL-12 och IL-15. Optimeringen av en sådan metod för mus uNK-celler skulle ge mer flexibilitet när man utför funktionella analyser och göra det möjligt att testa flera villkor med ett högre cellnummer. Å andra sidan är kulturförhållanden kända för att modifiera den unika fenotypen av lymfocyter och eventuellt deras funktion också.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar de tidigare och nuvarande teammedlemmarna som har hjälpt till att utveckla denna metod, inklusive Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic och Anita Qualls. Denna forskning finansierades av Wellcome Trust [Grant number 200841/Z/16/Z ] och Medical Research Council (MR/P001092/1). För öppen åtkomst har författaren tillämpat en CC BY offentlig upphovsrättslicens på alla författare accepterade manuskriptversioner som härrör från denna inlämning.
70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
BSA | Sigma | A9647-100G | |
CD19 antibody | BD | 562701 | |
CD3 antibody | BD | 562600 | |
CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
CD49a antibody | BD | 740262 | |
DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |