प्रोटीन थिओल ऑक्सीकरण में सामान्य शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों के तहत महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। हम एक मात्रात्मक रेडॉक्स प्रोटिओमिक्स विधि के विवरण का वर्णन करते हैं, जो राल-सहायता प्राप्त कैप्चर, आइसोबेरिक लेबलिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करता है, जिससे साइट-विशिष्ट पहचान और प्रोटीन के विपरीत ऑक्सीकृत सिस्टीन अवशेषों का परिमाणीकरण सक्षम होता है।
प्रोटीन थिओल पर प्रतिवर्ती ऑक्सीडेटिव संशोधन हाल ही में सेलुलर फ़ंक्शन के महत्वपूर्ण मध्यस्थों के रूप में उभरे हैं। यहां हम एक मात्रात्मक रेडॉक्स प्रोटिओमिक्स विधि की विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जो प्रोटिओम स्तर पर ऑक्सीकृत प्रोटीन थिओल के मल्टीप्लेक्स स्टोचियोमेट्रिक परिमाणीकरण की अनुमति देने के लिए टेंडम मास टैग (टीएमटी) आइसोबेरिक लेबलिंग और तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) के साथ संयोजन में राल-असिस्टेड कैप्चर (आरएसी) का उपयोग करता है। ऑक्सीकृत सिस्टीन अवशेषों पर साइट-विशिष्ट मात्रात्मक जानकारी ऐसे संशोधनों के कार्यात्मक प्रभावों में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।
वर्कफ़्लो कई नमूना प्रकारों में अनुकूलनीय है, जिसमें सुसंस्कृत कोशिकाएं (जैसे, स्तनधारी, प्रोकैरियोटिक) और पूरे ऊतक (जैसे, हृदय, फेफड़े, मांसपेशी) शामिल हैं, जिन्हें शुरू में लाइस्ड / होमोजिनाइज्ड किया जाता है और कृत्रिम ऑक्सीकरण को रोकने के लिए मुक्त थिओल को अल्काइलेटेड किया जाता है। ऑक्सीकृत प्रोटीन थिओल को तब कम किया जाता है और एक थिओल-आत्मीयता राल द्वारा कैप्चर किया जाता है, जो प्रोटीन / पेप्टाइड्स के अतिरिक्त हस्तांतरण के बिना पाचन, लेबलिंग और धोने की प्रक्रियाओं को आगे बढ़ाने की अनुमति देकर वर्कफ़्लो चरणों को सुव्यवस्थित और सरल बनाता है। अंत में, लेबल किए गए पेप्टाइड्स को एलसी-एमएस / एमएस द्वारा पूरे प्रोटिओम में थिओल ऑक्सीकरण से संबंधित व्यापक स्टोइकोमेट्रिक परिवर्तनों को प्रकट करने के लिए एल्यूट और विश्लेषण किया जाता है। यह विधि प्रोटीन थिओल ऑक्सीकरण से संबंधित शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल राज्यों के तहत रेडॉक्स-निर्भर विनियमन की भूमिका की समझ में काफी सुधार करती है।
होमियोस्टैटिक स्थितियों के तहत, कोशिकाएं प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन, नाइट्रोजन या सल्फर प्रजातियां उत्पन्न करती हैं जो प्रक्रियाओं को सुविधाजनक बनाने में मदद करती हैं, जैसे कि चयापचय और सिग्नलिंग 1,2,3, प्रोकैरियोट्स और यूकेरियोट्स दोनों तक फैली हुई हैं। इन प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के शारीरिक स्तर उचित सेलुलर फ़ंक्शन के लिए आवश्यक हैं, जिन्हें ‘यूस्ट्रेस’ 1,4 के रूप में भी जाना जाता है। इसके विपरीत, ऑक्सीडेंट में वृद्धि जो ऑक्सीडेंट और एंटीऑक्सिडेंट के बीच असंतुलन की ओर ले जाती है, ऑक्सीडेटिव तनाव, या ‘संकट’ 1 का कारण बन सकती है, जो सेलुलर क्षति की ओर ले जाती है। ऑक्सीडेंट प्रोटीन, डीएनए, आरएनए और लिपिड सहित विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स को संशोधित करके जैविक मार्गों पर संकेतों को ट्रांसड्यूस करते हैं। विशेष रूप से, प्रोटीन के सिस्टीन अवशेष अत्यधिक प्रतिक्रियाशील साइटें हैं जो सिस्टीन पर थिओल समूह के कारण ऑक्सीकरण के लिए प्रवण हैं, जो विभिन्न प्रकार के ऑक्सीडेंट5 के प्रति प्रतिक्रियाशील है। यह सिस्टीन के लिए प्रतिवर्ती रेडॉक्स-आधारित पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) की एक विविध श्रृंखला को जन्म देता है, जिसमें नाइट्रोसिलेशन (एसएनओ), ग्लूटाथियोनाइलेशन (एसएसजी), सल्फेनाइलेशन (एसओएच), परसल्फिडेशन (एसएसएच), पॉलीसल्फाइडेशन (एसएसएनएच), एसाइलेशन और डाइसल्फ़ाइड शामिल हैं। सिस्टीन ऑक्सीकरण के अपरिवर्तनीय रूपों में सल्फिनाइलेशन (एसओ2एच) और सल्फोनाइलेशन (एसओ3एच) शामिल हैं।
सिस्टीन अवशेषों के प्रतिवर्ती ऑक्सीडेटिव संशोधन आगे अपरिवर्तनीय ऑक्सीकरण को रोकने के लिए सुरक्षात्मक भूमिका निभा सकते हैं या डाउनस्ट्रीम सेलुलरमार्गों के लिए सिग्नलिंग अणुओं के रूप में काम कर सकते हैं। कुछ थिओल रेडॉक्स पीटीएम की रिवर्सबिलिटी सिस्टीन साइटों को “रेडॉक्स स्विच” 8,9 के रूप में कार्य करने की अनुमति देती है, जिसमें इन साइटों की रेडॉक्स स्थिति में परिवर्तन क्षणिक प्रक्रियाओं में उनकी भूमिका को विनियमित करने के लिए प्रोटीन फ़ंक्शन को बदल देता है। रेडॉक्स पीटीएम10 के मॉड्यूलेटरी प्रभावप्रोटीन फ़ंक्शन 11 के कई पहलुओं में देखे गए हैं, जिसमें उत्प्रेरण12, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन13, रचना परिवर्तन14, धातु आयन समन्वय15, या औषधीय अवरोधक बाइंडिंग16 शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, रेडॉक्स पीटीएम प्रोटीन के सिस्टीन साइटों में शामिल होते हैं जो प्रतिलेखन17, अनुवाद18, या चयापचय19 जैसे मार्गों को नियंत्रित करते हैं। प्रोटीन फ़ंक्शन और जैविक प्रक्रियाओं पर रेडॉक्स पीटीएम के प्रभाव को देखते हुए, ऑक्सीकरण की सीमा को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है जो एक सिस्टीन साइट रेडॉक्स अवस्था के गड़बड़ी के जवाब में गुजरती है।
परिवर्तित रेडॉक्स अवस्थाओं के साथ सिस्टीन साइटों की पहचान सामान्य और परेशान स्थितियों के बीच साइट-विशिष्ट स्तर पर ऑक्सीकरण स्थिति की तुलना पर केंद्रित है। फोल्ड परिवर्तन माप का उपयोग अक्सर यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि कौन सी साइटें काफी बदल गई हैं क्योंकि इससे उपयोगकर्ताओं को यह व्याख्या करने में मदद मिलती है कि अध्ययन के लिए सिस्टीन साइटें शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण हो सकती हैं। वैकल्पिक रूप से, एक विशिष्ट नमूना प्रकार में प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण के स्टोइकोमेट्रिक माप सेलुलर ऑक्सीकरण के संबंध में शारीरिक स्थिति की एक सामान्य तस्वीर देते हैं, एक महत्वपूर्ण माप जिसे अक्सर अनदेखा और कम उपयोग किया जाता है। संशोधन स्टोइकोमेट्री कुल प्रोटीन थिओल (संशोधित और असंशोधित) 20,21 के अनुपात के रूप में संशोधित थिओल के प्रतिशत को निर्धारित करने पर आधारित है। नतीजतन, स्टोइकोमेट्रिक माप फोल्ड परिवर्तन की तुलना में अधिक सटीक माप प्रदान करते हैं, खासकर जब मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करते हैं। ऑक्सीकरण में वृद्धि के महत्व को एक विशेष सिस्टीन साइट के पीटीएम अधिभोग को निर्धारित करने के लिए स्टोइकोमेट्री का उपयोग करके अधिक आसानी से पता लगाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, थिओल ऑक्सीकरण में 3 गुना वृद्धि 1% से 3% या 30% से 90% जितनी बड़ी संक्रमण के परिणामस्वरूप हो सकती है। एक साइट के लिए ऑक्सीकरण में 3 गुना वृद्धि जो केवल 1% अधिभोग पर है, प्रोटीन के कार्य पर बहुत कम प्रभाव डाल सकती है; हालांकि, आराम करने की स्थिति में 30% अधिभोग वाली साइट के लिए 3 गुना वृद्धि अधिक प्रभावित हो सकती है। स्टोइकोमेट्रिक माप, जब प्रोटीन ग्लूटाथियोनाइलेशन (एसएसजी) और नाइट्रोसिलेशन (एसएनओ) सहित कुल ऑक्सीकृत थिओल और विशिष्ट ऑक्सीडेटिव संशोधनों के बीच किया जाता है, तो विशिष्ट संशोधन प्रकारों के संबंध में अनुपात और मात्रात्मक जानकारी प्रकट कर सकता है।
क्योंकि प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण आम तौर पर एक कम-बहुतायत पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन है, जैविक नमूनों से इन संशोधनों वाले प्रोटीन के संवर्धन के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। जाफरी और अन्य द्वारा तैयार किए गए एक प्रारंभिक दृष्टिकोण, जिसे बायोटिन स्विच तकनीक (बीएसटी) 22 नाम दिया गया है, में कई चरण शामिल हैं, जिसमें अपरिवर्तित थिओल को क्षारीयीकरण के माध्यम से अवरुद्ध किया जाता है, विपरीत रूप से संशोधित थिओल को नवजात मुक्त थिओल में कम कर दिया जाता है, नवजात मुक्त थिओल को बायोटिन के साथ लेबल किया जाता है, और लेबल किए गए प्रोटीन को स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता पुलडाउन द्वारा समृद्ध किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग कई अध्ययनों में एसएनओ और एसएसजी को प्रोफाइल करने के लिए किया गया है और इसे प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण23,24 के अन्य रूपों के लिए जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जबकि बीएसटी का उपयोग प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण के विभिन्न रूपों की जांच के लिए किया गया है, इस दृष्टिकोण के साथ एक चिंता यह है कि संवर्धन स्ट्रेप्टाविडिन के लिए अनबायोटिनाइलेटेड प्रोटीन के गैर-विशिष्ट बंधन से प्रभावित होता है। हमारी प्रयोगशाला में विकसित एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, जिसका नाम राल-असिस्टेड कैप्चर (आरएसी) 25,26 (चित्रा 1) है, बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन प्रणाली के माध्यम से थिओल समूहों के संवर्धन के मुद्दे को दरकिनार करता है।
विपरीत रूप से ऑक्सीकृत थिओल की कमी के बाद, नवजात मुक्त थिओल वाले प्रोटीन थिओल-आत्मीयता राल द्वारा समृद्ध होते हैं, जो सहसंयोजक रूप से मुक्त थिओल समूहों को पकड़ता है, जिससे बीएसटी की तुलना में सिस्टीन युक्त प्रोटीन के अधिक विशिष्ट संवर्धन की अनुमति मिलती है। आइसोबेरिक लेबलिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री में हालिया प्रगति की मल्टीप्लेक्सिंग शक्ति के साथ आरएसी को जोड़ना प्रोटिओम-वाइड स्तर पर विपरीत रूप से ऑक्सीकृत सिस्टीन अवशेषों के संवर्धन, पहचान और परिमाणीकरण के लिए एक मजबूत और संवेदनशील वर्कफ़्लो बनाता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री में हालिया प्रगति ने थिओल रेडॉक्स प्रोटिओम की बहुत गहरी प्रोफाइलिंग को सक्षम किया है, जिससे प्रोटीन थिओल ऑक्सीकरण27 के कारण और प्रभाव दोनों की समझ बढ़ गई है। साइट-विशिष्ट मात्रात्मक डेटा से प्राप्त जानकारी प्रतिवर्ती ऑक्सीडेटिव संशोधनों के यांत्रिक प्रभावों और डाउनस्ट्रीम प्रभावों के आगे के अध्ययन की अनुमति देतीहै। इस वर्कफ़्लो का उपयोग करने से उम्र बढ़ने जैसी सामान्य शारीरिक घटनाओं के संबंध में प्रतिवर्ती सिस्टीन ऑक्सीकरण के शारीरिक प्रभावों में अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है, जिसमें एसएसजी का स्तर उम्र के संबंध में भिन्न होता है। एसएसजी पर उम्र बढ़ने के प्रभाव को एसएस -31 (एलामिप्रेटाइड) का उपयोग करके आंशिक रूप से उलट दिया गया था, एक नया पेप्टाइड जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बढ़ाता है और वृद्ध चूहों में एसएसजी के स्तर को कम करता है, जिससे उनके पास युवा चूहों के समान एसएसजी प्रोफाइल होताहै।
नैनोपार्टिकल एक्सपोजर के लिए जिम्मेदार पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों को माउस मैक्रोफेज मॉडल में एसएसजी को शामिल करने के लिए दिखाया गया है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित आरएसी का उपयोग करते हुए, लेखकों ने दिखाया कि एसएसजी स्तर सीधे ऑक्सीडेटिव तनाव की डिग्री और मैक्रोफेज फागोसाइटिक फ़ंक्शन की हानि से संबंधित थे। डेटा ने विभिन्न इंजीनियर नैनोमैटेरियल्स के जवाब में मार्ग-विशिष्ट अंतर का भी खुलासा किया जो ऑक्सीडेटिव तनाव30 के विभिन्न डिग्री को प्रेरित करते हैं। विधि ने प्रोकैरियोटिक प्रजातियों में भी अपनी उपयोगिता साबित की है, जहां इसे थिओल ऑक्सीकरण के संबंध में प्रकाश संश्लेषक साइनोबैक्टीरिया में दैनिक चक्रों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था। इलेक्ट्रॉन परिवहन, कार्बन निर्धारण और ग्लाइकोलाइसिस सहित कई प्रमुख जैविक प्रक्रियाओं में थिओल ऑक्सीकरण में व्यापक परिवर्तन देखे गए। इसके अलावा, ऑर्थोगोनल सत्यापन के माध्यम से, कई प्रमुख कार्यात्मक साइटों को संशोधित करने की पुष्टि की गई, जो इन ऑक्सीडेटिव संशोधनों की नियामक भूमिकाओं का सुझावदेते हैं।
यहां, हम एक मानकीकृत वर्कफ़्लो (चित्रा 1) के विवरण का वर्णन करते हैं, जो प्रोटीन के कुल ऑक्सीकृत सिस्टीन थिओल के संवर्धन के लिए आरएसी दृष्टिकोण की उपयोगिता और उनके बाद के लेबलिंग और स्टोइकोमेट्रिक परिमाणीकरण का प्रदर्शन करता है। इस वर्कफ़्लो को विभिन्न नमूना प्रकारों में रेडॉक्स अवस्था के अध्ययन में लागू किया गया है, जिसमें सेल कल्चर27,30 और पूरे ऊतक (जैसे, कंकाल की मांसपेशी, हृदय, फेफड़े) 29,31,32,33 शामिल हैं। हालांकि यहां शामिल नहीं है, आरएसी प्रोटोकॉल को एसएसजी, एसएनओ और एस-एसाइलेशन सहित प्रतिवर्ती रेडॉक्स संशोधनों के विशिष्ट रूपों की जांच के लिए आसानी से अनुकूलित किया गया है, जैसा कि पहले उल्लेख किया गयाथा 25,29,34।
सिस्टीन अवशेषों25,29,30 के ऑक्सीडेटिव संशोधनों की जांच के लिए विभिन्न प्रकार के नमूना प्रकारों और जैविक प्रणालियों में राल-सहायता प्राप्त कैप्चर का उपयोग किया गया है। ?…
The authors have nothing to disclose.
काम के कुछ हिस्सों को एनआईएच ग्रांट्स आर01 डीके122160, आर01 एचएल139335 और यू24 डीके112349 द्वारा समर्थित किया गया था
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | Reagent for in-house resin synthesis |
2.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 22431048 | |
5.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 30108310 | |
5.0 mL round bottom tubes | Falcon | 352054 | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
Activated Thiol–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potential replacement for thiol-affinity resin |
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Protein Assay Reagent |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
N-ethylmaleimide | Sigma Aldrich | 4259 | |
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagent for in-house resin synthesis |
QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
Spin columns | Thermo Scientific | 69705 | |
Strata C18-E reverse phase columns | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Peptide desalting |
Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details). |
TMT isobaric labels (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Peptide labeling reagent; available in multiple formats |
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Trypsin | Promega | V5820 | |
Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | vacuum concentrator |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |