Harpiksassistert fangst kombinert med isobarisk tandemmassemerkemerking for multiplekset kvantifisering av proteintioloksidasjon

Summary

Proteintioloksidasjon har betydelige implikasjoner under normale fysiologiske og patofysiologiske forhold. Vi beskriver detaljene i en kvantitativ redoks proteomikkmetode, som benytter harpiksassistert fangst, isobarisk merking og massespektrometri, noe som muliggjør stedsspesifikk identifisering og kvantifisering av reversibelt oksyderte cysteinrester av proteiner.

Abstract

Reversible oksidative modifikasjoner på proteintioler har nylig dukket opp som viktige mediatorer av cellulær funksjon. Her beskriver vi den detaljerte prosedyren for en kvantitativ redoks proteomikkmetode som benytter harpiksassistert fangst (RAC) i kombinasjon med tandemmassemerke (TMT) isobarisk merking og væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) for å tillate multiplekset stochiometrisk kvantifisering av oksyderte proteintioler på proteomnivå. Den stedsspesifikke kvantitative informasjonen om oksiderte cysteinrester gir ytterligere innsikt i de funksjonelle effektene av slike modifikasjoner.

Arbeidsflyten kan tilpasses på tvers av mange prøvetyper, inkludert dyrkede celler (f.eks. pattedyr, prokaryote) og hele vev (f.eks. hjerte, lunge, muskel), som i utgangspunktet lyses / homogeniseres og med frie tioler som alkyleres for å forhindre kunstig oksidasjon. De oksyderte proteintiolene reduseres og fanges deretter opp av en tiol-affinitetsharpiks, som effektiviserer og forenkler arbeidsflyttrinnene ved å tillate at prosedyrene for fortsatt fordøyelse, merking og vasking utføres uten ytterligere overføring av proteiner / peptider. Til slutt blir de merkede peptidene eluert og analysert av LC-MS / MS for å avsløre omfattende støkiometriske endringer relatert til tioloksydasjon over hele proteomet. Denne metoden forbedrer i stor grad forståelsen av rollen som redoksavhengig regulering under fysiologiske og patofysiologiske tilstander relatert til proteintioloksidasjon.

Introduction

Under homeostatiske forhold genererer celler reaktive oksygen-, nitrogen- eller svovelarter som bidrar til å lette prosesser, for eksempel metabolisme og signalering ^1,2,3, som strekker seg til både prokaryoter og eukaryoter. Fysiologiske nivåer av disse reaktive artene er nødvendige for riktig cellulær funksjon, også kjent som ‘^{eustress’1,4}. I motsetning til dette kan en økning i oksidanter som fører til ubalanse mellom oksidanter og antioksidanter forårsake oksidativt stress, eller “^nød”1, som fører til cellulær skade. Oksidanter transduserer signaler til biologiske veier ved å modifisere forskjellige biomolekyler, inkludert protein, DNA, RNA og lipider. Spesielt er cysteinrester av proteiner svært reaktive steder utsatt for oksidasjon på grunn av tiolgruppen på cystein, som er reaktiv mot forskjellige typer^oksidanter. Dette gir opphav til et mangfoldig utvalg av reversible redoksbaserte posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) for cystein, inkludert nitrosylering (SNO), glutationylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidasjon (SSH), polysulfidasjon (SS_nH), acylation og disulfides. Irreversible former for cysteinoksidasjon inkluderer sulfinylering (SO₂H) og sulfonylering (SO₃H).

Reversible oksidative modifikasjoner av cysteinrester kan tjene beskyttende roller som forhindrer ytterligere irreversibel oksidasjon eller tjene som signalmolekyler for nedstrøms cellulære veier ^6,7. Reversibiliteten til noen tiol redox PTM gjør at cysteinsteder kan fungere som “redoksbrytere”^8,9, hvor endringer i redokstilstanden til disse områdene endrer proteinfunksjonen for å regulere deres rolle i forbigående prosesser. De modulerende effektene av redoks PTM¹⁰ har blitt observert i mange aspekter av proteinfunksjon 11, inkludert katalyse 12, protein-protein-interaksjoner¹³, konformasjonsendring 14, metallionkoordinasjon 15 eller farmakologisk inhibitorbinding ¹⁶. I tillegg er redoks PTM involvert i cysteinsteder av proteiner som regulerer veier som transkripsjon 17, oversettelse¹⁸ eller metabolisme¹⁹. Gitt virkningen som redoks PTM har på proteinfunksjon og biologiske prosesser, er det viktig å kvantifisere omfanget av oksidasjon som et cysteinsted gjennomgår som svar på en forstyrrelse av redokstilstanden.

Identifiseringen av cysteinsteder med endrede redokstilstander er fokusert på sammenligning av oksidasjonstilstanden på det stedsspesifikke nivået mellom normale og forstyrrede forhold. Foldendringsmålinger brukes ofte til å bestemme hvilke steder som er betydelig endret, da dette hjelper brukerne til å tolke hvilke cysteinsteder som kan være fysiologisk signifikante for studien. Alternativt gir støkiometriske målinger av reversibel tioloksidasjon over en bestemt prøvetype et generelt bilde av den fysiologiske tilstanden med hensyn til cellulær oksidasjon, en viktig måling som ofte overses og underutnyttes. Modifikasjonsstøkiometri er basert på kvantifisering av prosentandelen modifisert tiol som et forhold til totalt proteintiol (modifisert og umodifisert)^20,21. Som et resultat gir støkiometriske målinger en mer presis måling enn foldeendring, spesielt ved bruk av massespektrometri. Betydningen av økningen i oksidasjon kan lettere fastslås ved å bruke støkiometri for å bestemme PTM-belegget på et bestemt cysteinsted. For eksempel kan en 3 ganger økning i tioloksidasjon skyldes en overgang på så lite som 1% til 3% eller så stor som 30% til 90%. En 3 ganger økning i oksidasjon for et sted som bare er ved 1% belegg, kan ha liten innvirkning på proteinets funksjon; Imidlertid kan en 3 ganger økning for et sted med 30% belegg i hviletilstand bli mer vesentlig påvirket. Støkiometriske målinger, når de utføres mellom totale oksyderte tioler og spesifikke oksidative modifikasjoner, inkludert proteinglutationylering (SSG) og nitrosylering (SNO), kan avsløre forhold og kvantitativ informasjon med hensyn til spesifikke modifikasjonstyper.

Fordi reversibel tioloksidasjon vanligvis er en lav-overflod posttranslasjonell modifikasjon, har flere tilnærminger blitt utviklet for anrikning av proteiner som inneholder disse modifikasjonene ut av biologiske prøver. En tidlig tilnærming utviklet av Jaffrey og andre, kalt biotinbryterteknikken (BST)²², involverer flere trinn hvor umodifiserte tioler blokkeres gjennom alkylering, reversibelt modifiserte tioler reduseres til begynnende frie tioler, begynnende frie tioler er merket med biotin, og de merkede proteinene er beriket av nedtrekk av streptavidinaffinitet. Denne teknikken har blitt brukt til å profilere SNO og SSG i mange studier og kan tilpasses for sonde for andre former for reversibel tioloksidasjon^23,24. Mens BST har blitt brukt til å sonde for ulike former for reversibel tioloksidasjon, er en bekymring med denne tilnærmingen at anrikning påvirkes av den ikke-spesifikke bindingen av ubiotinylerte proteiner til streptavidin. En alternativ tilnærming utviklet i vårt laboratorium, kalt harpiksassistert fangst (RAC) ^25,26 (figur 1), omgår spørsmålet om anrikning av tiolgrupper via biotin-streptavidin-systemet.

Etter reduksjon av reversibelt oksyderte tioler, blir proteiner med begynnende frie tioler beriket av tiol-affinitetsharpiksen, som kovalent fanger frie tiolgrupper, noe som muliggjør mer spesifikk anrikning av cysteinholdige proteiner enn BST. Kobling av RAC med multipleksingskraften til de siste fremskrittene innen isobarisk merking og massespektrometri skaper en robust og sensitiv arbeidsflyt for anrikning, identifisering og kvantifisering av reversibelt oksyderte cysteinrester på proteom-bredt nivå. Nylige fremskritt innen massespektrometri har muliggjort mye dypere profilering av tiol redoksproteomet, noe som øker forståelsen av både årsak og virkning av proteintioloksidasjon²⁷. Informasjonen fra stedsspesifikke kvantitative data muliggjør videre studier av mekanistiske virkninger og nedstrøms effekter av reversible oksidative modifikasjoner²⁸. Bruk av denne arbeidsflyten har gitt innsikt i de fysiologiske effektene av reversibel cysteinoksidasjon med hensyn til normale fysiologiske hendelser som aldring, hvor nivåene av SSG var forskjellige med hensyn til alder. Aldringseffektene på SSG ble delvis reversert ved bruk av SS-31 (elamipretid), et nytt peptid som forbedrer mitokondriell funksjon og reduserer SSG-nivåer hos eldre mus, noe som får dem til å ha en SSG-profil som ligner mer på unge mus²⁹.

Patofysiologiske forhold som tilskrives nanopartikkeleksponering har vist seg å involvere SSG i en musemakrofagmodell. Ved hjelp av RAC kombinert med massespektrometri viste forfatterne at SSG-nivåene var direkte korrelert med graden av oksidativt stress og nedsatt makrofagfagocytisk funksjon. Dataene avslørte også veispesifikke forskjeller i respons på forskjellige konstruerte nanomaterialer som induserer forskjellige grader av oksidativt stress³⁰. Metoden har også bevist sin nytte i prokaryote arter, hvor den ble brukt til å studere effekten av daglige sykluser i fotosyntetiske cyanobakterier med hensyn til tioloksidasjon. Brede endringer i tioloksidasjon på tvers av flere viktige biologiske prosesser ble observert, inkludert elektrontransport, karbonfiksering og glykolyse. Videre, gjennom ortogonal validering, ble flere viktige funksjonelle steder bekreftet å bli modifisert, noe som tyder på regulatoriske roller av disse oksidative modifikasjonene⁶.

Her beskriver vi detaljene i en standardisert arbeidsflyt (figur 1), som demonstrerer nytten av RAC-tilnærmingen for anrikning av totale oksyderte cysteintioler av proteiner og deres påfølgende merking og støkiometriske kvantifisering. Denne arbeidsflyten er implementert i studier av redokstilstanden i forskjellige prøvetyper, inkludert cellekulturer^27,30 og hele vev (f.eks. Skjelettmuskulatur, hjerte, lunge) 29,31,32,33. Selv om den ikke er inkludert her, er RAC-protokollen også lett tilpasset for undersøkelse av spesifikke former for reversible redoksmodifikasjoner, inkludert SSG, SNO og S-acylation, som tidligere nevnt^25,29,34.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet i protokollen knyttet til dyre- eller menneskeprøver/vev ble godkjent av og fulgte de institusjonelle retningslinjene til forskningsetisk komité for mennesker og dyr. 1. Prøvehomogenisering/lysis Frosne vevsprøverHakk frosset vev (~ 30 mg) på et glass mikroskop lysbilde på tørris ved hjelp av en forkjølt barberblad og tang. Overfør det hakkede vevet til et forkjølt 5 ml rundbunns polystyrenrør som inneholder 700 μL buffer A (se ta…

Representative Results

Fullføring av protokollen vil resultere i svært spesifikk anrikning av tidligere oksiderte cysteinholdige peptider, ofte med >95% spesifisitet 27,35,36. Imidlertid krever flere viktige trinn i protokollen spesiell oppmerksomhet, for eksempel den første blokkeringen av frie tioler før prøvelyse / homogenisering, som forbyr kunstig oksidasjon og ikke-spesifikk anrikning av kunstig oksyderte tioler25. P…

Discussion

Harpiksassistert fangst har blitt brukt på tvers av en rekke prøvetyper og biologiske systemer for undersøkelse av oksidative modifikasjoner av cysteinrester^25,29,30. Denne metoden tillater evaluering av prøver på flere nivåer og avlesninger, inkludert proteiner og peptider ved hjelp av SDS-PAGE og western blot-analyse, samt individuelle cysteinsteder ved hjelp av massespektrometri. Uavhengig av prøvetype eller endelig en…

Materials

2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236