Captura assistida por resina juntamente com marcação de massa em tandem isobárica para quantificação multiplexada da oxidação de proteína tiol

Summary

A oxidação do tiol proteico tem implicações significativas em condições fisiológicas e fisiopatológicas normais. Descrevemos os detalhes de um método proteômico redox quantitativo, que utiliza captura assistida por resina, marcação isobárica e espectrometria de massa, permitindo a identificação e quantificação específicas do local de resíduos de cisteína oxidada reversivelmente de proteínas.

Abstract

Modificações oxidativas reversíveis em tióis proteicos emergiram recentemente como importantes mediadores da função celular. Neste documento, descrevemos o procedimento detalhado de um método quantitativo de proteômica redox que utiliza captura assistida por resina (RAC) em combinação com marcação isobárica em tandem mass tag (TMT) e espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida (LC-MS/MS) para permitir a quantificação estequiométrica multiplexada de tióis de proteínas oxidadas no nível do proteoma. As informações quantitativas específicas do local sobre resíduos de cisteína oxidada fornecem informações adicionais sobre os impactos funcionais de tais modificações.

O fluxo de trabalho é adaptável em muitos tipos de amostras, incluindo células cultivadas (por exemplo, mamíferos, procarióticas) e tecidos inteiros (por exemplo, coração, pulmão, músculo), que são inicialmente lisados/homogeneizados e com tióis livres sendo alquilados para evitar a oxidação artificial. Os tióis de proteína oxidada são então reduzidos e capturados por uma resina de afinidade de tiol, que simplifica e simplifica as etapas do fluxo de trabalho, permitindo que os procedimentos de digestão, rotulagem e lavagem sejam realizados sem transferência adicional de proteínas / peptídeos. Finalmente, os peptídeos marcados são eluídos e analisados pelo LC-MS/MS para revelar mudanças estequiométricas abrangentes relacionadas à oxidação do tiol em todo o proteoma. Este método melhora muito a compreensão do papel da regulação dependente de redox sob estados fisiológicos e fisiopatológicos relacionados à oxidação do tiol proteico.

Introduction

Em condições homeostáticas, as células geram espécies reativas de oxigênio, nitrogênio ou enxofre que ajudam a facilitar processos, como o metabolismo e a sinalização ^1,2,3, estendendo-se tanto a procariotas quanto a eucariotos. Os níveis fisiológicos dessas espécies reativas são necessários para o bom funcionamento celular, também conhecido como ‘^{eustress’1,4}. Em contraste, um aumento nos oxidantes que leva a um desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes pode causar estresse oxidativo, ou “angústia”¹, o que leva a danos celulares. Os oxidantes transduzem sinais para vias biológicas modificando diferentes biomoléculas, incluindo proteínas, DNA, RNA e lipídios. Em particular, os resíduos de cisteína de proteínas são locais altamente reativos propensos à oxidação devido ao grupo tiol na cisteína, que é reativo a diferentes tipos de oxidantes⁵. Isso dá origem a uma gama diversificada de modificações pós-traducionais reversíveis baseadas em redox (PTMs) para cisteína, incluindo nitrosilação (SNO), glutationilação (SSG), sulfenilação (SOH), persulfidação (SSH), polissulfidação (SS_nH), acilação e dissulfetos. Formas irreversíveis de oxidação de cisteína incluem sulfinilação (SO₂H) e sulfonilação (SO₃H).

Modificações oxidativas reversíveis de resíduos de cisteína podem servir a papéis protetores que impedem uma oxidação irreversível adicional ou servir como moléculas sinalizadoras para as vias celulares a jusante ^6,7. A reversibilidade de alguns PTMs tiol redox permite que os sítios de cisteína funcionem como “interruptores redox”^8,9, em que mudanças no estado redox desses locais alteram a função da proteína para regular seu papel em processos transitórios. Os efeitos modulatórios dos PTMs redox 10 têm sido observados em muitos aspectos da função proteica 11, incluindo catálise 12, interações proteína-proteína 13, alteração de conformação¹⁴, coordenação de íons metálicos 15 ou ligação de inibidores farmacológicos ¹⁶. Além disso, os PTMs redox estão envolvidos em sítios de cisteína de proteínas que regulam vias como transcrição 17, tradução¹⁸ ou metabolismo¹⁹. Dado o impacto que os PTMs redox têm na função da proteína e nos processos biológicos, é importante quantificar a extensão da oxidação que um sítio de cisteína sofre em resposta a uma perturbação do estado redox.

A identificação de sítios de cisteína com estados redox alterados é focada na comparação do estado de oxidação no nível sítio-específico entre condições normais e perturbadas. As medições de mudança de dobra são frequentemente utilizadas para determinar quais locais são significativamente alterados, pois isso ajuda os usuários a interpretar quais locais de cisteína podem ser fisiologicamente significativos para o estudo. Alternativamente, as medições estequiométricas da oxidação reversível do tiol em um tipo de amostra específico fornecem uma imagem geral do estado fisiológico em relação à oxidação celular, uma medida importante que muitas vezes é negligenciada e subutilizada. A estequiometria de modificação baseia-se na quantificação da porcentagem de tiol modificado em relação ao tiol proteico total (modificado e não modificado)^20,21. Como resultado, as medições estequiométricas oferecem uma medição mais precisa do que a mudança de dobra, especialmente quando se usa espectrometria de massa. A significância do aumento da oxidação pode ser mais facilmente determinada usando estequiometria para determinar a ocupação de PTM de um determinado sítio de cisteína. Por exemplo, um aumento de 3 vezes na oxidação do tiol pode resultar de uma transição de apenas 1% a 3% ou de 30% a 90%. Um aumento de 3 vezes na oxidação para um local que está apenas em 1% de ocupação pode ter pouco impacto na função de uma proteína; no entanto, um aumento de 3 vezes para um local com 30% de ocupação no estado de repouso pode ser mais substancialmente afetado. As medições estequiométricas, quando realizadas entre tióis oxidados totais e modificações oxidativas específicas, incluindo glutationilação de proteínas (SSG) e nitrosilação (SNO), podem revelar razões e informações quantitativas em relação a tipos específicos de modificação.

Como a oxidação reversível do tiol é tipicamente uma modificação pós-traducional de baixa abundância, várias abordagens foram desenvolvidas para o enriquecimento de proteínas contendo essas modificações a partir de amostras biológicas. Uma abordagem inicial concebida por Jaffrey e outros, chamada de técnica de troca de biotina (BST)²², envolve várias etapas em que tióis não modificados são bloqueados por alquilação, tióis modificados reversivelmente são reduzidos a tióis livres nascentes, tióis livres nascentes são marcados com biotina e as proteínas marcadas são enriquecidas por pulldown de afinidade com estreptavidina. Essa técnica tem sido utilizada para traçar o perfil SNO e SSG em muitos estudos e pode ser adaptada para sondar outras formas de oxidação reversível do tiol^23,24. Embora o BST tenha sido utilizado para investigar diferentes formas de oxidação reversível do tiol, uma preocupação com essa abordagem é que o enriquecimento é afetado pela ligação não específica de proteínas não biotiniladas à estreptavidina. Uma abordagem alternativa desenvolvida em nosso laboratório, denominada captura assistida por resina (RAC)^25,26 (Figura 1), contorna a questão do enriquecimento dos grupos tiol por meio do sistema biotina-estreptavidina.

Após a redução dos tióis oxidados reversivelmente, as proteínas com tióis livres nascentes são enriquecidas pela resina tiol-afinidade, que captura covalentemente os grupos tiol livres, permitindo o enriquecimento mais específico das proteínas contendo cisteína do que a BST. O acoplamento do RAC com o poder de multiplexação dos recentes avanços na rotulagem isobárica e espectrometria de massa cria um fluxo de trabalho robusto e sensível para o enriquecimento, identificação e quantificação de resíduos de cisteína oxidados reversivelmente no nível de proteoma. Avanços recentes na espectrometria de massas permitiram um perfil muito mais profundo do proteoma tiol redox, aumentando a compreensão da causa e do efeito da oxidação do tiol proteico²⁷. As informações obtidas a partir de dados quantitativos site-specific permitem novos estudos dos impactos mecanicistas e dos efeitos a jusante das modificações oxidativas reversíveis²⁸. A utilização desse fluxo de trabalho forneceu informações sobre os impactos fisiológicos da oxidação reversível da cisteína em relação a eventos fisiológicos normais, como o envelhecimento, em que os níveis de SSG diferiram em relação à idade. Os efeitos do envelhecimento sobre o SSG foram parcialmente revertidos usando SS-31 (elamipretida), um novo peptídeo que melhora a função mitocondrial e reduz os níveis de SSG em camundongos idosos, fazendo com que eles tenham um perfil SSG mais semelhante ao de camundongos jovens²⁹.

As condições fisiopatológicas atribuídas à exposição a nanopartículas demonstraram envolver SSG em um modelo de macrófago de camundongo. Usando RAC juntamente com espectrometria de massa, os autores mostraram que os níveis de SSG estavam diretamente correlacionados com o grau de estresse oxidativo e comprometimento da função fagocítica dos macrófagos. Os dados também revelaram diferenças específicas da via em resposta a diferentes nanomateriais de engenharia que induzem diferentes graus de estresse oxidativo³⁰. O método também provou sua utilidade em espécies procarióticas, onde foi aplicado para estudar os efeitos dos ciclos diurnos em cianobactérias fotossintéticas em relação à oxidação do tiol. Amplas mudanças na oxidação do tiol em vários processos biológicos importantes foram observadas, incluindo transporte de elétrons, fixação de carbono e glicólise. Além disso, por meio da validação ortogonal, vários sítios funcionais chave foram confirmados para serem modificados, sugerindo papéis regulatórios dessas modificações oxidativas⁶.

Neste trabalho, descrevemos os detalhes de um fluxo de trabalho padronizado (Figura 1), demonstrando a utilidade da abordagem RAC para o enriquecimento de tióis de cisteína oxidada total de proteínas e sua subsequente marcação e quantificação estequiométrica. Esse fluxo de trabalho tem sido implementado em estudos do estado redox em diferentes tipos de amostras, incluindo culturas celulares^27,30 e tecidos inteiros (por exemplo, músculo esquelético, coração, pulmão)29,31,32,33. Embora não incluído aqui, o protocolo RAC também é facilmente adaptado para a investigação de formas específicas de modificações redox reversíveis, incluindo SSG, SNO e S-acilação, como mencionado anteriormente^25,29,34.

Protocol

Todos os procedimentos descritos no protocolo relacionados a amostras/tecidos animais ou humanos foram aprovados e seguiram as diretrizes institucionais do comitê de ética em pesquisa com seres humanos e animais. 1. Homogeneização/lise da amostra Amostras de tecido congeladoCarne de tecido congelado picado (~ 30 mg) em uma lâmina de microscópio de vidro em gelo seco usando uma lâmina de barbear pré-resfriada e pinças. Transferir o tecido picado para um tubo de polies…

Representative Results

O término do protocolo resultará em enriquecimento altamente específico de peptídeos contendo cisteína anteriormente oxidados, muitas vezes com especificidade de >95% 27,35,36. No entanto, várias etapas importantes do protocolo requerem atenção especial, por exemplo, o bloqueio inicial de tióis livres antes da lise/homogeneização da amostra, o que proíbe a oxidação artificial e o enriquecimento inespecífico de ti?…

Discussion

A captura assistida por resina tem sido utilizada em uma variedade de tipos de amostras e sistemas biológicos para a investigação de modificações oxidativas de resíduos de cisteína^25,29,30. Este método permite a avaliação de amostras em múltiplos níveis e leituras, incluindo proteínas e peptídeos usando SDS-PAGE e análise de western blot, bem como locais individuais de cisteína usando espectrometria de massa. Ind…

Materials

2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236