डेंड्राइटिक स्पाइन तंत्रिका तंत्र की महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषताएं हैं। यहां सी एलिगेंस में डेंड्राइटिक स्पाइन की संरचना और कार्य का आकलन करने के लिए लाइव इमेजिंग विधियों का वर्णन किया गया है। ये दृष्टिकोण जीन के लिए उत्परिवर्ती स्क्रीन के विकास का समर्थन करते हैं जो डेंड्राइटिक रीढ़ के आकार या कार्य को परिभाषित करते हैं।
डेंड्राइटिक स्पाइन गतिविधि द्वारा नियंत्रित सिनैप्टिक संक्रमण की विशेष साइटें हैं और सीखने और स्मृति के लिए सब्सट्रेट के रूप में कार्य करती हैं। हाल ही में, डीडी जीएबीएर्जिक न्यूरॉन्स के लिए डेंड्राइटिक स्पाइन को केनोरहाब्डिस एलिगेंस के मोटर सर्किट में प्रीसिनेप्टिक कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स से इनपुट साइटों के रूप में वर्णित किया गया है। यह सिनैप्टिक सर्किट अब स्पाइन मोर्फोजेनेसिस और फ़ंक्शन के विवो मॉडल में एक शक्तिशाली नए के रूप में काम कर सकता है जो आसान आनुवंशिकी और सी की तैयार पहुंच का फायदा उठाता है । लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एलिगेंस।
यह प्रोटोकॉल डीडी रीढ़ संरचना और कार्य का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक रणनीतियों का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण में, एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग रणनीति का उपयोग एक्टिन-समृद्ध डेंड्राइटिक स्पाइन के जटिल आकार की कल्पना करने के लिए किया जाता है। डीडी स्पाइन फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए, प्रकाश-सक्रिय ऑप्सिन, क्रिमसन, प्रीसिनेप्टिक कोलिनर्जिक न्यूरॉन्स को उत्तेजित करता है, और कैल्शियम संकेतक, जीसीएएमपी, पोस्टसिनेप्टिक डीडी स्पाइन में उत्पन्न कैल्शियम क्षणिकता की रिपोर्ट करता है। साथ में, इन विधियों में सी एलिगेंस में डेंड्राइटिक स्पाइन के आनुवंशिक निर्धारकों की पहचान करने के लिए शक्तिशाली दृष्टिकोण शामिल हैं जो मस्तिष्क में स्पाइन मोर्फोजेनेसिस और कार्य को भी निर्देशित कर सकते हैं।
डेंड्राइटिक स्पाइन विशेष सेलुलर संरचनाएं हैं जो सिनैप्टिक ट्रांसमिशन के लिए पड़ोसी न्यूरॉन्स से इनपुट प्राप्त करती हैं। न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स का सक्रियण इन विशिष्ट न्यूरोनल प्रोट्रूशियंस में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्गों को बढ़ाता है। न्यूरोट्रांसमिशन के लिए डेंड्राइटिक स्पाइन के मौलिक महत्व और न्यूरोडेवलपमेंटल रोगों में उनके गलत विनियमनके कारण, डेंड्राइटिक स्पाइन मोर्फोजेनेसिस और फ़ंक्शन को संशोधित करने वाले कारकों की खोज तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में उच्च रुचि है।
हाल ही में, स्तनधारी रीढ़ 2 के साथ साझा की गई प्रमुख विशेषताओं के आधार पर सी एलिगेंस तंत्रिका तंत्र में डेंड्राइटिक स्पाइनकी पहचान की गई है। यह निर्धारण महत्वपूर्ण है क्योंकि यह रीढ़ जीव विज्ञान की जांच के लिए सी एलिगेंस के फायदों का फायदा उठाने की संभावना खोलता है। पृष्ठीय डी (डीडी) मोटर न्यूरॉन्स पर डेंड्राइटिक स्पाइन वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड (चित्रा 1 ए) 2,3,4 में कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स (वीए और वीबी) से इनपुट प्राप्त करते हैं। यहां, डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन की संरचना और एक बरकरार तंत्रिका तंत्र में विवो में उनके कार्य का पता लगाने के लिए इमेजिंग विधियां प्रस्तुत की जाती हैं जो लाइव इमेजिंग और आनुवंशिक विश्लेषण के लिए आसानी से सुलभ है। डेंड्राइटिक स्पाइन के आकार की निगरानी के लिए, (1) साइटोसोलिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जो डेंड्राइटिक प्रक्रिया और रीढ़ को भरते हैं; (2) झिल्ली-बाध्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जो डेंड्राइटिक स्पाइन और डेंड्राइट की सीमा को सजाते हैं; या (3) एक्टिन मार्कर, लाइफएक्ट5 या यूट्रोफिन6, जो डेंड्राइटिक स्पाइन में समृद्ध होते हैं, का उपयोग किया जाता है, इस प्रकार उनके आकार का खुलासा होता है। डीडी स्पाइन की कार्यक्षमता की निगरानी करने के लिए, जीसीएएमपी फ्लोरेसेंस का उपयोग प्रीसिनेप्टिक कोलिनर्जिक न्यूरॉन्स 7 में लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन, क्रिमसन के सक्रियण से उत्पन्न सीए ++ क्षणिकता का पता लगाने के लिए किया जाताहै। दोनों रणनीतियों से जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती जानवरों में डीडी डेंड्राइटिक स्पाइन के अध्ययन की सुविधा मिलने की उम्मीद है।
एयरिस्कैन डिटेक्टर को डीडी स्पाइन के स्नैपशॉट प्राप्त करने के लिए चुना गया था क्योंकि यह पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप19,20 की तुलना में उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात और बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। एयरीस्कैन इमेजिंग पारंपरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, जीएफपी, एमचेरी, आदि) के उपयोग की भी अनुमति देता है, जो अब सी एलिगेंस के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध है। यद्यपि उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधियों (जैसे, स्टॉर्म, एसटीईडी, पाम) के साथ प्राप्त किया जा सकता है, इन विधियों को फोटो-एक्टिवेबल या फोटो-स्विचेबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन21 की आवश्यकता होती है। एयरिस्कैन के विकल्प के रूप में, पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की सिफारिश की जाती है। उदाहरण के लिए, Nyquist अधिग्रहण (चित्रा 3) के साथ इमेजिंग 123.9 nm के 40x/ 1.3 उद्देश्य का उपयोग करके पिक्सेल आकार प्राप्त करती है, जो रीढ़ की रूपात्मक प्रकारों को अलग करने के लिए पर्याप्त है (चित्रा 2)।
रीढ़ की हड्डी के घनत्व का निर्धारण करने के लिए, एक साइटोसोलिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे (1) एमचेरी या जीएफपी, (2) लाइफएक्ट का उपयोग करके एक्टिन साइटोस्केलेटन को लेबल किया जाता है, या (3) प्लाज्मा झिल्ली (चित्रा 1 बी) को लेबल करने के लिए एक मायरिस्टोइलेटेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, एमवाईआर:: एमरूबी) की सिफारिश की जाती है। इसकी तुलना में, एफ-एक्टिन बाइंडिंग प्रोटीन यूट्रोफिन रीढ़ घनत्व को कम करता है (चित्रा 1 सी), यूट्रोफिन को अधिक व्यक्त किए जाने पर स्पाइन मोर्फोजेनेसिस पर नकारात्मक प्रभाव का संकेत देता है।
वर्तमान इमेजिंग विधियों को आनुवंशिक वेरिएंट की पहचान करने में मदद करनी चाहिए जो रीढ़ की आकृति विज्ञान 1,16 को नियंत्रित करते हैं। डीडी रीढ़ आकृति विज्ञान (यानी, पतली / मशरूम, फिलोपोडियाल, स्टब्बी, ब्रांकेड, चित्रा 2 देखें) का मूल्यांकन उदर तंत्रिका कॉर्ड पार्श्व छवियों के एकल 2 डी-अनुमानों से किया जा सकता है क्योंकि अधिकांश डीडी रीढ़ एक विशिष्ट रूप से उदर-निर्देशित अभिविन्यास को अपनाते हैं। इन तुलनाओं में, प्रत्येक स्थिति के लिए एक ही फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करना आवश्यक है क्योंकि स्पष्ट रीढ़ रूपात्मक प्रकार लेबलिंग विधि से प्रभावित होते हैं (उदाहरण के लिए, MYR:: mRuby vs। लाइफ एक्ट:: जीएफपी)। इसके अलावा, यह ध्यान दिया गया कि रीढ़ की हड्डी के आकार गतिशील हैं और बाहरी संकेतों 2,16 के जवाब में आकार बदलने की संभावना है। इस प्रकार, समान विकास चरणों में और समान परिस्थितियों में जीनोटाइप के बीच रीढ़ की हड्डी के आकार की तुलना करना भी आवश्यक है।
एलिगेंस वेंट्रल कॉर्ड का अभिविन्यास सटीक छवि अधिग्रहण के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। जानवर के विपरीत किनारों पर उदर और पृष्ठीय डोरियों दोनों को एक ही जेड-प्लेन में दिखाई देना चाहिए, यह दर्शाता है कि कीड़ा इसकी तरफ उन्मुख है (चित्रा 1 बी)। उदर कॉर्ड के पास अन्य कीड़े या बुलबुले के संपर्क में आने वाले कीड़े की छवियों को इकट्ठा करना सबसे अच्छा नहीं है, क्योंकि यह रीढ़ की छवियों को नीचा दिखा सकता है।
विवो कैल्शियम इमेजिंग में , प्रत्येक अधिग्रहण से तुरंत पहले ताजा स्लाइड तैयार करने की आवश्यकता होती है। केवल पतले गोंद फाइबर बनाम के संपर्क में कीड़े की छवि बनाना सबसे अच्छा है। गोंद के “ग्लब्स” जो कीड़े को विकृत करते हैं और छवि को नीचा दिखाते हैं (चित्रा 4 बी)। चित्रा 4 में दिखाए गए प्रयोग में, 561 एनएम प्रकाश की पल्स पूरे दृश्य क्षेत्र को सक्रिय करती है। स्थानीय सीए ++ ट्रांसिएंट्स का पता लगाने के लिए अस्थायी और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने के लिए, उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत डीडी स्पाइन के भीतर, 561 एनएम लेजर लाइन के लिए स्थापित एक गैल्वो मिनी स्कैनर का उपयोग रुचि के एक छोटे क्षेत्र को उत्तेजित करने के लिए किया जा सकताहै।
The authors have nothing to disclose.
इमारिस पर इमेजिंग और विश्लेषण एनआईएच (सीए 68485, डीके 20593, डीके 58404, डीके 59637 और ईवाई08126) द्वारा समर्थित वेंडरबिल्ट सेल इमेजिंग शेयर्ड रिसोर्स (सीआईआरएस) में किया गया था। LSM 880 अनुदान 1S10OD201630 द्वारा समर्थित है। एक निकॉन स्पिनिंग डिस्क पर इमेजिंग निकोन सेंटर ऑफ एक्सीलेंस में किया गया था। हम प्रशिक्षण और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए जेनी शेफर, सीआईएसआर निदेशक और ब्रायन मिलिस और बर्नेट प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं: डायलन बर्नेट, एडन फेनिक्स और निलय तनेजा सलाह के लिए। इस काम को डीएमएम (R01NS081259 और R01NS106951) के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान और एसीसी (18PRE33960581) के लिए अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
Microscope for super-resolution imaging | |||
LSM880 | Zeiss | ||
AiryScan detector | Zeiss | ||
Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
Laser lines | |||
Stage controller | |||
Microscope for Nyquist image acquisition | |||
A1R Confocal | Nikon | ||
Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
488 nm, 16mW | |||
561 nm, 17mW | |||
Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
Andor DU-897 EMCCD camera | |||
Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
488 nm, 65mW | |||
561 nm, 86mW | |||
525 nm (+/- 18 nm) | |||
605 nm (+/- 35 nm) |