オンコ分解性ヘルペスシンプレックスウイルスの増殖、精製、滴定
Summary
本稿では、前臨床用の単純ヘルペスウイルスの増殖、精製、滴定の簡単な方法について述べる。
Abstract
腫瘍分解性ヘルペス単純ヘルペスウイルス(oHSV)などの腫瘍分解ウイルス(OV)は、がん免疫療法の分野で急速に成長している治療戦略です。oHSVを含むOVは、抗腫瘍免疫を誘導しながら、癌細胞(健康/正常細胞を温見する)で選択的に複製し、殺す。これらのユニークな特性のために、oHSVベースの治療戦略は、FDA承認タリモジーンラヘルパレベック(T-Vec)を含む、前臨床的および臨床的に癌の治療のためにますます使用されています。成長、精製、滴定は、実験的研究に活用する前に、oHSVを含むあらゆるOVに不可欠な3つの実験室技術です。本論文では、Vero細胞でoHSVを増幅する簡単なステップバイステップの方法について述べている。oHSVが増殖するにつれて、ベロ細胞に細胞パシー効果(CPE)を生み出す。感染細胞の90〜100%がCPEを示すと、それらは穏やかに収穫され、ベンゾナーゼおよび塩化マグネシウム(MgCl2)で処理され、濾過され、スクロース勾配法を用いて精製を行う。精製後、感染性oHSV(プラーク形成単位またはPPFとして指定される)の数は、Vero細胞における「プラークアッセイ」によって決定される。本明細書に記載されたプロトコルは、細胞培養および生体内動物実験におけるインビトロ研究のための高い対値oHSVストックを調製するために使用することができる。
Introduction
腫瘍分解ウイルス(OV)は、がん免疫療法の新しいユニークな形態です。OVは、抗腫瘍免疫を誘導しながら腫瘍細胞(正常/健康細胞を温かく温かみ)1に選択的に複製およびライゼする。単純ヘルペスウイルス(oHSV)は、すべてのOVの中で最も広範に研究されたウイルスの一つです。それは、タリモジーン・ラヘルパレプベック(T-VEC)が進行黒色腫3の治療のために米国でFDAの承認を受けた最初で唯一のOVである、診療所で最も遠いです。T-VECに加えて、他の多くの遺伝子組み換えoHSVは、異なる癌タイプ3、4、5、6、7、8で前臨床的および臨床的にテストされている。現在の高度な組換えDNAバイオテクノロジーは、治療トランスジーン3、5にコードする新しいoHSVをエンジニアリングする可能性をさらに高めています。oHSVの伝播、精製、およびタイターの決定の効率的なシステムは、(新しく開発された)oHSVをインビトロおよびインビボ研究のためにテストする前に重要である。本論文ではoHSV成長(ベロ細胞)、精製(ショ糖勾配法による)、および滴定(Vero細胞におけるoHSVプラークアッセイによる)の簡単なステップバイステップの方法について説明する(図1)。これは、任意のバイオセーフティレベル2(BSL2)実験室の設定で簡単に前臨床試験のための高品質のウイルスストックを達成するために採用することができます。
ベロは、アフリカの緑色のサルの腎臓細胞株であり、vero細胞が欠陥のある抗ウイルスインターフェロンシグナル伝達経路14を有するoHSV伝播9、10、11、12、13に最も一般的に使用される細胞株である。インターフェロン遺伝子の不活性化刺激因子(STING)シグナル伝達を有する他の細胞株も、oHSV増殖12,13に使用することができる。このプロトコルは、oHSV増殖およびプラークアッセイのためにベロ細胞を利用する。伝播後、oHSV感染細胞は、採取、分解、精製を行い、そこで、細胞をまずベンゾナーゼヌクレアーゼで処理して宿主細胞DNAを分解し、核酸タンパク質凝集を防止し、細胞ライセートの粘度を低下させる。ベンゾナーゼの適切な活性化は、多くの場合、Mg2+を必要とするため、1-2 mM MgCl2がこのプロトコル15で使用されます。ベンゾナーゼ処理細胞リセートからの宿主細胞の破片は、高速スクロース勾配遠心分離の前に連続濾過によってさらに除去される。粘性25%のスクロース溶液クッションは、スクロース層を介したウイルス移動の速度を遅くし、宿主細胞関連成分を上清に残し、ペレット16の浄化およびウイルス損失の制限を改善するのに役立つ。精製されたoHSVは、次いでベロ細胞上で滴定され、そしてウイルスプラークは、17またはX-gal染色(LacZコードoHSV用)18のギムサ染色によって視覚化される。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルは、低通路ベロ細胞におけるoHSVの増殖から始まる。Vero細胞単層の合流率は、増殖細胞がVero細胞20へのoHSVの侵入を減少させることができるタイトな線維構造を開発することができるので、ウイルス接種時に〜80%であるべきである。90〜100%CPEが観察されると、培養上清が除去され、細胞が収穫され、VB/上清(ステップ1.4.6を参照)に再懸濁され、スナップ凍結、後で精…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
サハラボの研究は、DOD(W81XWH-20-1-0702)とダッジ・ジョーンズ財団-アビリーンからの資金によって部分的に支援されました。サミュエル・D・ラブキンとメリッサ・R.MハンフリーはNIH(R01 CA160762)によって部分的にサポートされました。
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
Riferimenti
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