Vekst, rensing og titrering av onkolytisk herpes Simplex Virus
Summary
I dette manuskriptet beskriver vi en enkel metode for vekst, rensing og titrering av det onkolytiske herpes simplex-viruset for preklinisk bruk.
Abstract
Onkolytiske virus (OVs), som onkolytisk herpes simplex virus (oHSV), er en raskt voksende behandlingsstrategi innen kreftimmunoterapi. OVer, inkludert oHSV, replikerer selektivt i og dreper kreftceller (sparer sunne / normale celler) mens de induserer anti-tumorimmunitet. På grunn av disse unike egenskapene blir oHSV-baserte behandlingsstrategier i økende grad brukt til behandling av kreft, preklinisk og klinisk, inkludert FDA-godkjent talimogene laherparevec (T-Vec). Vekst, rensing og titrering er tre viktige laboratorieteknikker for alle OVer, inkludert oHSVer, før de kan brukes til eksperimentelle studier. Dette dokumentet beskriver en enkel trinnvis metode for å forsterke oHSV i Vero-celler. Etter hvert som oHSVer multipliserer, produserer de en cytopatisk effekt (CPE) i Vero-celler. Når 90-100% av de infiserte cellene viser en CPE, blir de forsiktig høstet, behandlet med benzonase og magnesiumklorid (MgCl2), filtrert og utsatt for rensing ved hjelp av sukrosegradientsmetoden. Etter rensing bestemmes antall smittsomme oHSV (betegnet som plakkdannende enheter eller PFUer) av en “plakkanalyse” i Vero-celler. Protokollen som er beskrevet her, kan brukes til å forberede høytitrener oHSV-lager for in vitro-studier i cellekultur og in vivo dyreforsøk.
Introduction
Onkolytiske virus (OVer) er en fremvoksende og unik form for kreftimmunoterapi. OVer replikerer selektivt i og lyse tumorceller (sparer normale / sunne celler)1 mens de induserer anti-tumorimmunitet2. Onkolytisk herpes simplex virus (oHSV) er en av de mest omfattende studerte virus blant alle OVer. Det er lengst med i klinikken, med Talimogene laherparepvec (T-VEC) som den første og eneste OV som mottar FDA-godkjenning i USA for behandling av avansert melanom3. I tillegg til T-VEC blir mange andre genmodifiserte oHSVer testet preklinisk og klinisk i forskjellige krefttyper3,4,5,6,7,8. Den nåværende avanserte rekombinante DNA bioteknologi har ytterligere økt muligheten for å konstruere nye oHSVs koding for terapeutiske transgene (er)3,5. Et effektivt system for oHSV-forplantning, rensing og titerbestemmelse er avgjørende før noen (nyutviklet) oHSV kan testes for in vitro- og in vivo-studier. Dette dokumentet beskriver en enkel trinnvis metode for oHSV-vekst (i Vero-celler), rensing (ved sukrosegradientmetoden) og titrering (ved en oHSV-plakkanalyse i Vero-celler) (Figur 1). Det kan enkelt tas i bruk i alle Biosafety Level 2 (BSL2) laboratorieinnstillinger for å oppnå en høy kvalitet viral lager for prekliniske studier.
Vero, en afrikansk grønn ape nyrecellelinje, er den mest brukte cellelinjen for oHSV-forplantning9,10,11,12,13 da Vero-celler har en defekt antiviral interferonsignaleringsvei14. Andre cellelinjer med inaktivert stimulator av interferongener (STING) signalering kan også brukes til oHSV vekst12,13. Denne protokollen benytter Vero-celler for oHSV-vekst og plakkanalyse. Etter forplantning høstes, lyser og utsettes oHSV-infiserte celler for rensing, hvor lysede celler først behandles med benzonasekjernen for å forringe vertscelle-DNA, forhindre nukleinsyreproteinaggregering og redusere viskositeten til cellelysatet. Som riktig aktivering av benzonase krever ofte Mg2 +, 1-2 mM MgCl2 brukes i denne protokollen15. Vertscellerester fra benzonasebehandlet cellelysat elimineres ytterligere ved seriell filtrering før høyhastighets sukrosegradient sentrifugering. En viskøs 25% sukrose løsning pute bidrar til å sikre en langsommere grad av virusmigrering gjennom sukroselaget, slik at vertscellerelaterte komponenter blir igjen i supernatanten, og dermed forbedrer rensing og begrenser virustap ipellets 16. Den rensede oHSV titreres deretter på Vero-celler, og virale plakk visualiseres av Giemsa-flekker17 eller X-gal farging (for LacZ-koding av oHSVer)18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen starter med veksten av oHSV i veroceller med lav passasje. Sammenløpet av Vero-cellemonolayeren bør være ~ 80% på tidspunktet for virusinokulering, da overgrodde celler kan utvikle tette fibrøse strukturer som kan redusere oHSV-oppføring i Vero-celler20. Når 90-100% CPE er observert, fjernes kulturen supernatant, celler høstes, resuspenderes i VB / supernatant (se trinn 1.4.6), snap-frossen og lagres ved -80 °C for senere rensing. Blaho og kollegene brukte en litt annen metode…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Saha-laboratoriet ble delvis støttet av midler fra DOD (W81XWH-20-1-0702) og Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin og Melissa R.M. Humphrey ble delvis støttet av NIH (R01 CA160762).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
Riferimenti
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -. M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Diefenbach, R. J., Fraefel, C. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
