Tillväxt, rening och titrering av onkolytisk herpes simplex virus
Summary
I detta manuskript beskriver vi en enkel metod för tillväxt, rening och titrering av onkolytiska herpes simplex virus för preklinisk användning.
Abstract
Onkolytiska virus (OVs), såsom onkolytiska herpes simplex virus (oHSV), är en snabbt växande behandlingsstrategi inom området cancer immunterapi. OVs, inklusive oHSV, replikerar selektivt i och dödar cancerceller (skonar friska /normala celler) samtidigt som de inducerar antitumörimmunitet. På grund av dessa unika egenskaper används oHSV-baserade behandlingsstrategier alltmer för behandling av cancer, prekliniskt och kliniskt, inklusive FDA-godkänd talimogene laherparevec (T-Vec). Tillväxt, rening och titrering är tre viktiga laboratorietekniker för alla OVs, inklusive oHSVs, innan de kan användas för experimentella studier. Detta dokument beskriver en enkel steg-för-steg metod för att förstärka oHSV i Vero celler. När oHSVs multipliceras producerar de en cytopatisk effekt (CPE) i Vero-celler. När 90-100% av de infekterade cellerna visar en CPE skördas de försiktigt, behandlas med benzonas och magnesiumklorid (MgCl2),filtreras och utsätts för rening med hjälp av sackarosgradientmetoden. Efter rening bestäms antalet infektiösa oHSV (betecknade som plackbildande enheter eller PFC) av en “plackanalys” i Vero-celler. Protokollet som beskrivs häri kan användas för att förbereda hög titer oHSV-bestånd för in vitro-studier i cellkultur och in vivo-djurförsök.
Introduction
Onkolytiska virus (OVs) är en framväxande och unik form av cancer immunterapi. OVs replikerar selektivt i och lyse tumörceller (skonar normala / friska celler)1 medan inducera anti-tumör immunitet2. Onkolytiskt herpes simplexvirus (oHSV) är ett av de mest studerade virusen bland alla OVs. Det är längst fram på kliniken, med Talimogene laherparepvec (T-VEC) som den första och enda OV som får FDA-godkännande i USA för behandling av avancerat melanom3. Förutom T-VEC testas många andra genetiskt konstruerade oHSVs prekliniskt och kliniskt i olika cancertyper3,4,5,6,7,8. Den nuvarande avancerade rekombinanta DNA-biotekniken har ytterligare ökat genomförbarheten av att konstruera nya oHSVs-kodning för terapeutiska transgener3,5. Ett effektivt system för oHSV-förökning, rening och titerbestämning är avgörande innan någon (nyutvecklad) oHSV kan testas för in vitro- och in vivo-studier. Detta dokument beskriver en enkel steg-för-steg-metod för oHSV-tillväxt (i Vero-celler), rening (med sackarosgradientmetoden) och titrering (med en oHSV-plackanalys i Vero-celler) (figur 1). Det kan enkelt antas i alla Biosafety Level 2 (BSL2) laboratorieinställning för att uppnå ett högkvalitativt viruslager för prekliniska studier.
Vero, en afrikansk grön apa njure cellinje, är den vanligaste cellinjen för oHSV förökning9,10,11,12,13 som Vero celler har en defekt antivirala interferon signalering väg14. Andra cellinjer med inaktiverad stimulator av interferongener (STING) signalering kan också användas för oHSV tillväxt12,13. Detta protokoll använder Vero celler för oHSV tillväxt och plack analys. Efter förökning skördas, lysas och utsätts oHSV-infekterade celler för rening, där lysade celler först behandlas med benzonaskärna för att bryta ner värdcellens DNA, förhindra nukleinsyraproteinaggregering och minska celllystikens viskositet. Eftersom korrekt aktivering av benzonas ofta kräver Mg2 +, används 1-2 mM MgCl2 i detta protokoll15. Värdcellsskräp från benzonasbehandlade celllyat elimineras ytterligare genom seriell filtrering före höghastighets sackarosgradientcentrifugation. En trögflytande 25% sackaroslösningskudde hjälper till att säkerställa en långsammare virusmigration genom sackarosskiktet, vilket lämnar värdcellsrelaterade komponenter i supernaten, vilket förbättrar reningen och begränsar virusförlusten i pelleten16. Den renade oHSV titreras sedan på Vero-celler, och virala plack visualiseras av Giemsafärgning 17 eller X-gal färgning (för LacZ kodning oHSVs)18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet börjar med tillväxten av oHSV i veroceller med låg passage. Vero-cellmonoskiktens beredskap bör vara ~ 80% vid tidpunkten för virusinympning eftersom övervuxna celler kan utveckla snäva fibrösa strukturer som kan minska oHSV-inträde i Vero-celler20. När 90-100% CPE observeras avlägsnas kulturens supernatant, celler skördas, återanvänds i VB/supernatant (se steg 1.4.6), fästfryses och lagras vid -80 °C för senare rening. Blaho och kollegor använde en något annorlunda …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen i Saha-labbet stöddes delvis av medel från DOD (W81XWH-20-1-0702) och Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin och Melissa R.M. Humphrey stöddes delvis av NIH (R01 CA160762).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
Riferimenti
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -. M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Diefenbach, R. J., Fraefel, C. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
