グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング
Summary
このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。
Abstract
スクロース密度勾配遠心分離によるポリソーム分画は、リボソームプロファイルの作成、リボソームによって翻訳されている特定のmRNAの同定、およびポリソーム関連因子の分析に使用できる強力なツールです。この技術では、自動グラジエントメーカーとグラジエント分画システムが一般的に使用されますが、これらのシステムは一般的に高価であり、リソースが限られている、または研究のためにこの方法を実行する頻度が低いか時折必要ないために費用を正当化できないラボにとっては法外なコストになる可能性があります。ここでは、特殊な分画装置なしでほとんどの分子生物学研究室で利用可能な標準装置を使用して、ポリソームプロファイルを再現性よく生成するためのプロトコルが提示されています。さらに、グラジエント分画システムの有無にかかわらず生成されたポリソームプロファイルの比較が提供されます。再現性のあるポリソームプロファイルを最適化して生成するための戦略について説明します。 サッカロミセス・セレビシエ は、このプロトコルのモデル生物として利用されています。ただし、このプロトコルは、多くの異なる生物および細胞タイプのリボソームプロファイルを生成するために簡単に変更および適合させることができます。
Introduction
リボソームは、mRNAをタンパク質に翻訳する基本的なプロセスを実行するメガダルトンリボ核タンパク質複合体です。リボソームは、細胞内のすべてのタンパク質の合成を実行する役割を果たします。真核生物のリボソームは、沈降係数に応じて小さなリボソームサブユニット(40S)と大きなリボソームサブユニット(60S)として指定された2つのサブユニットで構成されています。完全に組み立てられたリボソームは80Sモノソームとして指定されます。ポリソームは、単一のmRNA分子の翻訳に従事するリボソームのグループです。スクロース密度勾配遠心分離によるポリソーム分画は、リボソームプロファイルの作成、翻訳リボソームに関連する特定のmRNAの同定、およびポリソーム関連因子の分析に使用される強力な方法です1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 、13。この技術は、単一のリボソーム、リボソームサブユニット、およびメッセンジャーリボ核タンパク質粒子からポリソームを分離するためによく使用されます。分画から得られたプロファイルは、ポリソーム14の翻訳活性およびリボソーム15、16、17の集合状態に関する貴重な情報を提供することができる。
リボソーム集合は、リボソーム集合因子18、19、20、21として知られるタンパク質群によって促進される非常に複雑なプロセスである。これらの因子は、ATPアーゼ、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ、GTPアーゼ、RNAヘリカーゼ、およびRNA結合タンパク質を含む他の多くのタンパク質との相互作用を通じて、リボソーム生合成中に幅広い機能を果たします22。ポリソーム分画は、リボソームアセンブリにおけるこれらの因子の役割を調査するために使用される強力なツールです。例えば、この方法は、pre-rRNAプロセシング因子であるポリヌクレオチドキナーゼGrc3の変異がリボソームアセンブリプロセスにどのように悪影響を及ぼし得るかを実証するために利用されている17,23。ポリソームプロファイリングはまた、ATPase Rix7内の保存されたモチーフがリボソーム産生にどのように不可欠であるかを強調し、示しています16。
ポリソーム分画の手順は、目的の細胞から可溶性細胞ライセートを作ることから始まります。ライセートは、RNA、リボソームサブユニット、およびポリソーム、ならびに他の可溶性細胞成分を含有する。連続的な直線的なスクロース勾配は、超遠心チューブ内で行われます。細胞ライセートの可溶性画分は、スクロース勾配チューブの上部に穏やかにロードされます。次に、装填された勾配チューブを遠心分離にかけ、重力によってスクロース勾配内のサイズによって細胞成分を分離します。大きいコンポーネントは、小さいコンポーネントよりも勾配にさらに移動します。グラデーションの上部には、小さくて移動の遅い細胞成分が格納され、大きくて移動の速い細胞成分は下部にあります。遠心分離後、チューブの内容物をフラクションとして収集します。この方法は、リボソームサブユニット、モノソーム、およびポリソームを効果的に分離します。次いで、各画分の光学濃度は、波長254nmにおける分光吸光度を測定することによって決定される。吸光度対分数を比較すると、ポリソームプロファイルが得られます。
線形スクロース密度勾配は、勾配メーカーを利用して生成することができる。遠心分離後、グラジエントはしばしば分画され、吸光度は自動密度分画システム3、7、13、24、25を用いて測定される。これらのシステムはポリソームプロファイルを生成するのに非常にうまく機能しますが、高価であり、一部のラボでは法外なコストがかかる可能性があります。ここでは、これらの機器を使用せずにポリソームプロファイルを生成するためのプロトコルが提示されています。代わりに、このプロトコルは、ほとんどの分子生物学研究室で通常利用可能な機器を利用します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、高価な自動分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを作成する方法について説明しました。この方法の利点は、自動分画システムを持たないラボがポリソームプロファイリングにアクセスできることです。このプロトコルの主な欠点は、専用の密度分画システムと比較して、面倒な手の分画と感度の低下です。
このプロトコルでは、リボソームサ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、この原稿を批判的に読んでくれたパーシー・タンバレ博士とメリッサ・ウェルズ博士に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所の壁内研究プログラムによってサポートされました。米国国立環境衛生科学研究所(NIEHS;ZIA ES103247 から R.E.S.
Materials
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
Riferimenti
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