Polysomprofilering uden gradueringsproducenter eller fraktioneringssystemer
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man genererer en polysomprofil uden at bruge automatiserede gradientproducenter eller gradientfraktioneringssystemer.
Abstract
Polysomfraktionering ved saccharosedensitetsgradientcentrifugering er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at skabe ribosomprofiler, identificere specifikke mRNA’er, der oversættes af ribosomer, og analysere polysomassocierede faktorer. Mens automatiserede gradientproducenter og gradientfraktioneringssystemer ofte bruges med denne teknik, er disse systemer generelt dyre og kan være uoverkommelige for laboratorier, der har begrænsede ressourcer eller ikke kan retfærdiggøre udgiften på grund af deres sjældne eller lejlighedsvise behov for at udføre denne metode til deres forskning. Her præsenteres en protokol til reproducerbar generering af polysomprofiler ved hjælp af standardudstyr, der er tilgængeligt i de fleste molekylærbiologiske laboratorier uden specialiserede fraktioneringsinstrumenter. Desuden tilvejebringes en sammenligning af polysomprofiler genereret med og uden et gradientfraktioneringssystem. Strategier til optimering og produktion af reproducerbare polysomprofiler diskuteres. Saccharomyces cerevisiae anvendes som en modelorganisme i denne protokol. Denne protokol kan dog let ændres og tilpasses til at generere ribosomprofiler for mange forskellige organismer og celletyper.
Introduction
Ribosomer er mega-Dalton ribonukleoproteinkomplekser, der udfører den grundlæggende proces med at oversætte mRNA til proteiner. Ribosomer er ansvarlige for at udføre syntesen af alle proteiner i en celle. Eukaryote ribosomer omfatter to underenheder udpeget som den lille ribosomale underenhed (40S) og den store ribosomale underenhed (60S) i henhold til deres sedimentationskoefficienter. Det fuldt samlede ribosom betegnes som 80’ernes monosom. Polysomer er grupper af ribosomer, der beskæftiger sig med at oversætte et enkelt mRNA-molekyle. Polysomfraktionering ved saccharosedensitetsgradientcentrifugering er en kraftfuld metode, der bruges til at skabe ribosomprofiler, identificere specifikke mRNA’er forbundet med oversættelse af ribosomer og analysere polysomassocierede faktorer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Denne teknik bruges ofte til at adskille polysomer fra enkelte ribosomer, ribosomale underenheder og messenger ribonukleoproteinpartikler. Profilerne opnået ved fraktionering kan give værdifuld information om oversættelsesaktiviteten af polysomer14 og samlingsstatus for ribosomerne15,16,17.
Ribosomsamling er en meget kompleks proces lettet af en gruppe proteiner kendt som ribosomsamlingsfaktorer 18,19,20,21. Disse faktorer udfører en bred vifte af funktioner under ribosombiogenese gennem interaktioner med mange andre proteiner, herunder ATPaser, endo- og exo-nukleaser, GTPaser, RNA-helicases og RNA-bindende proteiner22. Polysomfraktionering har været et kraftfuldt værktøj, der bruges til at undersøge disse faktorers rolle i ribosomsamling. For eksempel er denne metode blevet brugt til at demonstrere, hvordan mutationer i polynukleotidkinasen Grc3, en præ-rRNA-behandlingsfaktor, kan påvirke ribosomsamlingsprocessennegativt 17,23. Polysomprofilering har også fremhævet og vist, hvordan de bevarede motiver i ATPase Rix7 er afgørende for ribosomproduktionen16.
Proceduren for polysomfraktionering begynder med at fremstille opløselige cellelysater fra celler af interesse. Lysatet indeholder RNA, ribosomale underenheder og polysomer samt andre opløselige cellulære komponenter. En kontinuerlig, lineær saccharosegradient fremstilles i et ultracentrifugerør. Den opløselige fraktion af cellelysat lægges forsigtigt på toppen af saccharosegradientrøret. Det belastede gradientrør udsættes derefter for centrifugering, som adskiller de cellulære komponenter efter størrelse inden for saccharosegradienten ved tyngdekraften. De større komponenter bevæger sig længere ind i gradienten end de mindre komponenter. Toppen af gradienten huser de mindre, langsommere rejsende cellulære komponenter, mens de større, hurtigere rejsende cellulære komponenter findes i bunden. Efter centrifugering opsamles rørets indhold som fraktioner. Denne metode adskiller effektivt ribosomale underenheder, monosomer og polysomer. Den optiske tæthed af hver fraktion bestemmes derefter ved at måle spektralabsorbansen ved en bølgelængde på 254 nm. Plotning af absorbans vs. brøktal giver en polysomprofil.
Lineære saccharosetæthedsgradienter kan genereres ved hjælp af en gradientproducent. Efter centrifugering fraktioneres gradienter ofte, og absorbanser måles ved hjælp af et automatiseret densitetsfraktioneringssystem 3,7,13,24,25. Mens disse systemer fungerer meget godt til at producere polysomprofiler, er de dyre og kan være uoverkommelige for nogle laboratorier. Her præsenteres en protokol til generering af polysomprofiler uden brug af disse instrumenter. I stedet bruger denne protokol udstyr, der typisk er tilgængeligt i de fleste molekylærbiologiske laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her er en metode til at skabe polysomprofiler uden brug af dyre automatiserede fraktioneringssystemer blevet beskrevet. Fordelen ved denne metode er, at den gør polysomprofilering tilgængelig for laboratorier, der ikke har automatiserede fraktioneringssystemer. De største ulemper ved denne protokol er kedelig håndfraktionering og reduceret følsomhed sammenlignet med det dedikerede densitetsfraktioneringssystem.
Denne protokol indebærer omhyggelig forberedelse af saccharosegradienter med …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Percy Tumbale og Dr. Melissa Wells for deres kritiske læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af US National Institute of Health Intramural Research Program; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S).
Materials
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
Riferimenti
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E. Eukaryotic ribosome assembly. Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
