Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen
Summary
Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.
Abstract
Polysoomfractionering door sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om ribosoomprofielen te maken, specifieke mRNA’s te identificeren die worden vertaald door ribosomen en polysoomgerelateerde factoren te analyseren. Hoewel geautomatiseerde gradiëntmakers en gradiëntfractioneringssystemen vaak worden gebruikt met deze techniek, zijn deze systemen over het algemeen duur en kunnen ze onbetaalbaar zijn voor laboratoria die beperkte middelen hebben of de kosten niet kunnen rechtvaardigen vanwege hun onregelmatige of incidentele noodzaak om deze methode uit te voeren voor hun onderzoek. Hier wordt een protocol gepresenteerd om reproduceerbaar polysoomprofielen te genereren met behulp van standaardapparatuur die beschikbaar is in de meeste moleculair biologische laboratoria zonder gespecialiseerde fractioneringsinstrumenten. Bovendien wordt een vergelijking van polysomische profielen gegenereerd met en zonder een gradiëntfractioneringssysteem verstrekt. Strategieën om reproduceerbare polysoomprofielen te optimaliseren en te produceren worden besproken. Saccharomyces cerevisiae wordt in dit protocol gebruikt als modelorganisme. Dit protocol kan echter eenvoudig worden aangepast en aangepast om ribosoomprofielen te genereren voor veel verschillende organismen en celtypen.
Introduction
Ribosomen zijn mega-Dalton ribonucleoproteïnecomplexen die het fundamentele proces van het vertalen van mRNA in eiwitten uitvoeren. Ribosomen zijn verantwoordelijk voor het uitvoeren van de synthese van alle eiwitten in een cel. Eukaryote ribosomen bestaan uit twee subeenheden die worden aangeduid als de kleine ribosomale subeenheid (40S) en de grote ribosomale subeenheid (60S) op basis van hun sedimentatiecoëfficiënten. Het volledig geassembleerde ribosoom wordt aangeduid als het 80S monosoom. Polysomen zijn groepen ribosomen die zich bezighouden met het vertalen van een enkel mRNA-molecuul. Polysoomfractionering door sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie is een krachtige methode die wordt gebruikt om ribosoomprofielen te maken, specifieke mRNA’s te identificeren die verband houden met het vertalen van ribosomen en polysoomassociatiefactorente analyseren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Deze techniek wordt vaak gebruikt om polysomen te scheiden van enkele ribosomen, ribosomale subeenheden en messenger ribonucleoproteïnedeeltjes. De profielen verkregen uit fractionering kunnen waardevolle informatie opleveren over de translatieactiviteit van polysomen14 en de assemblagestatus van de ribosomen 15,16,17.
Ribosoomassemblage is een zeer complex proces dat wordt vergemakkelijkt door een groep eiwitten die bekend staat als ribosoomassemblagefactoren 18,19,20,21. Deze factoren vervullen een breed scala aan functies tijdens ribosoombiogenese door interacties met vele andere eiwitten, waaronder ATPasen, endo- en exo-nucleasen, GTPases, RNA-helicases en RNA-bindende eiwitten22. Polysoomfractionering is een krachtig hulpmiddel dat wordt gebruikt om de rol van deze factoren in ribosoomassemblage te onderzoeken. Deze methode is bijvoorbeeld gebruikt om aan te tonen hoe mutaties in het polynucleotidekinase Grc3, een pre-rRNA-verwerkingsfactor, het ribosoomassemblageproces negatief kunnen beïnvloeden17,23. Polysoomprofilering heeft ook benadrukt en aangetoond hoe de geconserveerde motieven in de ATPase Rix7 essentieel zijn voor ribosoomproductie16.
De procedure voor polysoomfractionering begint met het maken van oplosbare cellysaten uit interessante cellen. Het lysaat bevat RNA, ribosomale subeenheden en polysomen, evenals andere oplosbare cellulaire componenten. Een continue, lineaire sucrosegradiënt wordt gemaakt in een ultracentrifugebuis. De oplosbare fractie van cellysaat wordt voorzichtig op de bovenkant van de sucrosegradiëntbuis geladen. De geladen gradiëntbuis wordt vervolgens onderworpen aan centrifugatie, die de cellulaire componenten scheidt op grootte binnen de sucrosegradiënt door de zwaartekracht. De grotere componenten reizen verder in de gradiënt dan de kleinere componenten. De bovenkant van de gradiënt herbergt de kleinere, langzamer reizende cellulaire componenten, terwijl de grotere, sneller reizende cellulaire componenten aan de onderkant te vinden zijn. Na centrifugatie wordt de inhoud van de buis verzameld als fracties. Deze methode scheidt effectief ribosomale subeenheden, monosomen en polysomen. De optische dichtheid van elke fractie wordt vervolgens bepaald door de spectrale absorptie te meten bij een golflengte van 254 nm. Het plotten van absorptie versus fractiegetal levert een polysoomprofiel op.
Lineaire sucrosedichtheidsgradiënten kunnen worden gegenereerd met behulp van een gradiëntmaker. Na centrifugatie worden gradiënten vaak gefractioneerd en absorptiewaarden gemeten met behulp van een geautomatiseerd dichtheidsfractioneringssysteem 3,7,13,24,25. Hoewel deze systemen heel goed werken om polysoomprofielen te produceren, zijn ze duur en kunnen ze voor sommige laboratoria onbetaalbaar zijn. Hier wordt een protocol gepresenteerd om polysomische profielen te genereren zonder het gebruik van deze instrumenten. In plaats daarvan maakt dit protocol gebruik van apparatuur die doorgaans beschikbaar is in de meeste laboratoria voor moleculaire biologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier is een methode beschreven om polysomische profielen te maken zonder het gebruik van dure geautomatiseerde fractioneringssystemen. Het voordeel van deze methode is dat het polysome profilering toegankelijk maakt voor laboratoria die geen geautomatiseerde fractioneringssystemen hebben. De belangrijkste nadelen van dit protocol zijn vervelende handfractionering en verminderde gevoeligheid in vergelijking met het speciale dichtheidsfractioneringssysteem.
Dit protocol omvat een zorgvuldige voo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Percy Tumbale en Dr. Melissa Wells voor hun kritische lezing van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse National Institute of Health Intramural Research Program; Amerikaans Nationaal Instituut voor Milieugezondheidswetenschappen (NIEHS; ZIA ES103247 naar R.E.S).
Materials
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
Riferimenti
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E. Eukaryotic ribosome assembly. Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
