تقييم النشاط المضاد للأورام في الجسم الحي للجسيمات النانوية Polyanhydride IL-1α
Summary
يوصف بروتوكول قياسي لدراسة النشاط المضاد للأورام والسمية المرتبطة ب IL-1α في نموذج فأر متزامن من HNSCC.
Abstract
العلاج بالسيتوكين هو استراتيجية علاجية مناعية واعدة يمكن أن تنتج استجابات مناعية قوية مضادة للأورام لدى مرضى السرطان. تم تقييم السيتوكين الالتهابي إنترلوكين -1 ألفا (IL-1α) كعامل مضاد للسرطان في العديد من الدراسات قبل السريرية والسريرية. ومع ذلك ، فإن السمية التي تحد من الجرعة ، بما في ذلك الأعراض الشبيهة بالإنفلونزا وانخفاض ضغط الدم ، قد أضعفت الحماس لهذه الاستراتيجية العلاجية. سيمثل تسليم IL-1α القائم على الجسيمات النانوية متعددة الهيدريد (NP) نهجا فعالا في هذا السياق لأن هذا قد يسمح بإطلاق بطيء وخاضع للرقابة ل IL-1α بشكل منهجي مع تقليل الآثار الجانبية السامة. هنا يتم وصف تحليل للنشاط المضاد للأورام ل NPs polyanhydride المحملة ب IL-1α في نموذج الفأر الجيني لسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC). تم حقن الخلايا الظهارية الفموية البلعومية التي تعبر بثبات عن فيروس الورم الحليمي البشري 16 E6 / E7 مع خلايا hRAS و luciferase (mEERL) تحت الجلد في الجناح الأيمن للفئران C57BL / 6J. بمجرد وصول الأورام إلى 3-4 مم في أي اتجاه ، تم إعطاء تركيبة الجسيمات النانوية IL-1a 1.5٪ المحملة 20:80 1،8-مكرر (p-carboxyphenoxy) -3،6-dioxaoctane: 1،6-bis (p-carboxyphenoxy) hexane (CPTEG: CPH) تركيبة الجسيمات النانوية (IL-1α-NP) للفئران داخل الصفاق. تم قياس حجم الورم ووزن الجسم بشكل مستمر حتى وصل حجم الورم أو فقدان الوزن إلى معايير القتل الرحيم. تم أخذ عينات الدم لتقييم الاستجابات المناعية المضادة للأورام عن طريق بزل الوريد تحت الفك السفلي ، وتم قياس السيتوكينات الالتهابية من خلال مقايسات السيتوكينات المتعددة. تم استئصال الورم والغدد الليمفاوية الأربية وتجانسها في تعليق أحادي الخلية لتحليل الخلايا المناعية المختلفة من خلال قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. ستسمح هذه الطرق القياسية للباحثين بدراسة الاستجابة المناعية المضادة للأورام والآلية المحتملة ل NPs المناعية وعوامل العلاج المناعي الأخرى لعلاج السرطان.
Introduction
أحد المجالات الناشئة في العلاج المناعي للسرطان هو استخدام السيتوكينات الالتهابية لتنشيط الجهاز المناعي للمرضى ضد الخلايا السرطانية. يمكن للعديد من السيتوكينات المسببة للالتهابات (أي إنترفيرون ألفا (IFNα) وإنترلوكين -2 (IL-2) وإنترلوكين -1 (IL-1)) تكوين مناعة كبيرة مضادة للأورام ، مما أثار الاهتمام باستكشاف الخصائص المضادة للأورام بالإضافة إلى سلامة الأدوية القائمة على السيتوكين. إنترلوكين -1 ألفا (IL-1α) على وجه الخصوص ، هو السيتوكين الالتهابي المعروف باسم السيتوكين الرئيسي للالتهاب1. منذ اكتشاف هذا السيتوكين في أواخر 1970s ، تم التحقيق فيه كعامل مضاد للسرطان وكذلك دواء مكون للدم لعلاج الآثار السلبية للعلاج الكيميائي2. خلال أواخر 1980s ، أجريت العديد من الدراسات قبل السريرية والسريرية لتحديد الآثار المضادة للسرطان من IL-1α3،4،5،6. وجدت هذه الدراسات نشاطا واعدا مضادا للأورام ل IL-1α المؤتلف (rIL-1α) ضد سرطان الجلد وسرطان الخلايا الكلوية وسرطان المبيض. ومع ذلك ، لوحظت السميات ، بما في ذلك الحمى والغثيان والقيء والأعراض الشبيهة بالإنفلونزا ، وانخفاض ضغط الدم الأكثر حدة الذي يحد من الجرعة. لسوء الحظ ، أدت هذه السمية المرتبطة بالجرعة إلى تثبيط الحماس لمزيد من الاستخدام السريري ل rIL-1α.
لمحاولة معالجة القضية الحرجة المتمثلة في السمية بوساطة IL-1α ، سيتم التحقيق في تركيبات الجسيمات النانوية متعددة الأنهيدريد (NP) التي تسمح بالإطلاق الخاضع للرقابة ل IL-1α بواسطة حركية تآكل السطح. تهدف تركيبات NP هذه إلى جني فوائد الخصائص المضادة للأورام ل IL-1α مع تقليل الآثار الجانبية التي تحد من الجرعة7. Polyanhydrides هي بوليمرات معتمدة من إدارة الغذاء والدواء تتحلل من خلال تآكل السطح مما يؤدي إلى إطلاق ما يقرب من الصفر من العوامل المغلفة8،9،10،11،12. تم الإبلاغ عن أن البوليمرات المشتركة متعددة الهيدريد البرمائية التي تحتوي على 1،8-مكرر – (p-carboxyphenoxy) -3،6-dioxaoctane (CPTEG) و 1،6-مكرر (p-carboxyphenoxy) الهكسان (CPH) ، هي أنظمة توصيل ممتازة لمختلف الحمولات في علم الأورام والبحوث القائمة على المناعة 8،12. في البروتوكول التالي 20:80 CPTEG: CPH NPs المحملة ب 1.5٪ بالوزن٪ rIL-1α (IL-1α-NPs) سيتم استخدامها لدراسة النشاط المضاد للأورام وسمية هذا السيتوكين في نموذج فأر من HNSCC.
الهدف العام من الإجراءات التالية هو تقييم النشاط المضاد للأورام ل IL-1α-NPs على HNSCCs. يمكن تطبيق الإجراءات الموصوفة ، بما في ذلك تقييم نمو الورم والبقاء على قيد الحياة ، على أي عامل تعديل مناعي ذي أهمية. يجب تنفيذ هذه الإجراءات في نموذج فأر syngeneic مع نظام مناعي سليم13 لتحقيق أقصى قدر من الأهمية السريرية. كما سيتم تقييم سمية IL-1α-NP عن طريق قياس التغيرات في مستويات السيتوكينات المسببة للالتهابات ووزن الحيوان. هناك العديد من الطرق لتحديد سمية الدواء في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن الطرق الأكثر استخداما تتضمن قياس إنزيمات المصل لسمية الأعضاء والتغيرات النسيجية في تلك الأعضاء. ومع ذلك ، لإجراء التحليلات النسيجية ، يجب التضحية بالحيوان ، مما سيؤثر على منحنيات البقاء على قيد الحياة في التجربة. لذلك ، سيتضمن هذا البروتوكول بروتوكولا لجمع الدم من الفئران الحية لقياس السيتوكينات في عينات المصل. يمكن استخدام المصل الذي تم جمعه لقياس أي تحليلات مصل مرغوبة لسمية الأعضاء. سيتم استخدام قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان لفهم التغيرات في عدد الخلايا المناعية في البيئة المكروية للورم وهجرة الخلايا المناعية إلى العقدة الليمفاوية. يمكن استخدام طرق أخرى لتحديد الخلايا المناعية ، بما في ذلك الكيمياء المناعية و / أو التألق المناعي للأقسامالمحفوظة 14. ومع ذلك ، يمكن أن تستغرق هذه التقنيات وقتا طويلا ومملة لأدائها على عدد كبير من الحيوانات. بشكل عام ، ستسمح الطرق التالية للباحثين بدراسة الاستجابة المناعية المضادة للأورام والآليات المحتملة لعوامل التحفيز المناعي لعلاج السرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
سيسمح هذا البروتوكول لأي باحث بدراسة النشاط المضاد للأورام وبعض الآليات الأساسية للأدوية المعدلة للمناعة في نظام نموذج فأر الورم في الجسم الحي . هنا ، تم استخدام نموذج الورم تحت الجلد الجيني ، والذي له العديد من المزايا على نماذج تقويم العظام ، بما في ذلك بروتوكوله المباشر تقنيا ، وا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل #I01BX004829 جائزة مراجعة الاستحقاق من الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) قسم شؤون المحاربين القدامى ، خدمة البحث والتطوير في المختبرات الطبية الحيوية وبدعم من برنامج جائزة Mezhir من خلال مركز هولدن الشامل للسرطان في جامعة أيوا.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Riferimenti
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
