Bewertung der in vivo Antitumoraktivität von Polyanhydrid IL-1α Nanopartikeln
Summary
Es wird ein Standardprotokoll beschrieben, um die Antitumoraktivität und die damit verbundene Toxizität von IL-1α in einem syngenen Mausmodell von HNSCC zu untersuchen.
Abstract
Die Zytokintherapie ist eine vielversprechende immuntherapeutische Strategie, die bei Krebspatienten eine robuste Antitumor-Immunantwort hervorrufen kann. Das proinflammatorische Zytokin Interleukin-1 alpha (IL-1α) wurde in mehreren präklinischen und klinischen Studien als krebshemmendes Mittel untersucht. Dosislimitierende Toxizitäten, einschließlich grippeähnlicher Symptome und Hypotonie, haben jedoch die Begeisterung für diese therapeutische Strategie gedämpft. Die auf Polyanhydrid-Nanopartikeln (NP) basierende Verabreichung von IL-1α wäre in diesem Zusammenhang ein wirksamer Ansatz, da dies eine langsame und kontrollierte Freisetzung von IL-1α systemisch ermöglichen und gleichzeitig toxische Nebenwirkungen reduzieren kann. Hier wird eine Analyse der Antitumoraktivität von IL-1α-beladenen Polyanhydrid-NPs in einem syngenen Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) syngenen Mausmodell beschrieben. In die rechte Flanke von C57BL/6J-Mäusen wurden murine oropharyngeale Epithelzellen, die HPV16 E6/E7 stabil exprimieren, zusammen mit hRAS- und Luciferase-Zellen (mEERL) injiziert. Sobald die Tumoren 3-4 mm in jede Richtung erreichten, wurde Mäusen intraperitoneal eine 1,5% IL-1a – beladene 20:80 1,8-Bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctan:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexan (CPTEG: CPH) Nanopartikel (IL-1α-NP) verabreicht. Tumorgröße und Körpergewicht wurden kontinuierlich gemessen, bis die Tumorgröße oder der Gewichtsverlust die Euthanasiekriterien erreichten. Blutproben wurden entnommen, um Antitumor-Immunantworten durch submandibuläre Venenpunktion zu bewerten, und inflammatorische Zytokine wurden durch Zytokin-Multiplex-Assays gemessen. Tumor- und Leistenlymphknoten wurden reseziert und zu einer Einzelzellsuspension homogenisiert, um verschiedene Immunzellen mittels Multicolor-Durchflusszytometrie zu analysieren. Diese Standardmethoden werden es den Forschern ermöglichen, die Antitumor-Immunantwort und den potenziellen Mechanismus von immunstimulierenden NPs und anderen Immuntherapeutika für die Krebsbehandlung zu untersuchen.
Introduction
Einer der aufstrebenden Bereiche der Krebsimmuntherapie ist der Einsatz von inflammatorischen Zytokinen, um das Immunsystem der Patienten gegen ihre Tumorzellen zu aktivieren. Mehrere proinflammatorische Zytokine (z. B. Interferon-alpha (IFNα), Interleukin-2 (IL-2) und Interleukin-1 (IL-1)) können eine signifikante Antitumorimmunität aufbauen, was das Interesse an der Erforschung der Antitumoreigenschaften sowie der Sicherheit von Zytokin-basierten Medikamenten geweckt hat. Insbesondere Interleukin-1 alpha (IL-1α) ist ein proinflammatorisches Zytokin, das als Master-Zytokin der Entzündung1 bekannt ist. Seit der Entdeckung dieses Zytokins in den späten 1970er Jahren wurde es sowohl als Krebsmittel als auch als hämatopoetisches Medikament zur Behandlung der negativen Auswirkungen der Chemotherapieuntersucht 2. In den späten 1980er Jahren wurden mehrere präklinische und klinische Studien durchgeführt, um die krebshemmende Wirkung von IL-1α 3,4,5,6 zu bestimmen. Diese Studien fanden eine vielversprechende Antitumoraktivität von rekombinantem IL-1α (rIL-1α) gegen Melanom, Nierenzellkarzinom und Ovarialkarzinom. Toxizitäten, einschließlich Fieber, Übelkeit, Erbrechen, grippeähnliche Symptome und am schwersten dosislimitierende Hypotonie, wurden jedoch häufig beobachtet. Leider dämpften diese dosisabhängigen Toxizitäten die Begeisterung für die weitere klinische Anwendung von rIL-1α.
Um das kritische Problem der IL-1α-vermittelten Toxizitäten anzugehen, werden Polyanhydrid-Nanopartikel (NP)-Formulierungen untersucht, die eine kontrollierte Freisetzung von IL-1α durch Oberflächenerosionskinetik ermöglichen. Diese NP-Formulierungen sollen die Vorteile der Antitumoreigenschaften von IL-1α nutzen und gleichzeitig dosislimitierende Nebenwirkungen reduzieren7. Polyanhydride sind von der FDA zugelassene Polymere, die durch Oberflächenerosion abgebaut werden, was zu einer nahezu Null-Ordnungs-Freisetzung von verkapselten Wirkstoffen 8,9,10,11,12 führt. Amphiphile Polyanhydrid-Copolymere, die 1,8-Bis-(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctan (CPTEG) und 1,6-Bis-(p-carboxyphenoxy)hexan (CPH) enthalten, haben sich als ausgezeichnete Verabreichungssysteme für verschiedene Nutzlasten in der onkologischen und immunologischen Forschung erwiesen 8,12. Im folgenden Protokoll 20:80 werden CPTEG:CPH NPs, die mit 1,5 Gew.% rIL-1α (IL-1α-NPs) beladen sind, verwendet, um die Antitumoraktivität und Toxizität dieses Zytokins in einem Mausmodell von HNSCC zu untersuchen.
Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren ist es, die Antitumoraktivität von IL-1α-NPs auf HNSCCs zu bewerten. Die beschriebenen Verfahren, einschließlich der Beurteilung des Tumorwachstums und des Überlebens, können auf jedes immunmodulatorische Mittel von Interesse angewendet werden. Diese Verfahren sollten in einem syngenen Mausmodell mit einem intakten Immunsystem13 durchgeführt werden, um die klinische Relevanz zu maximieren. Die IL-1α-NP-Toxizität wird auch durch Messung von Veränderungen der zirkulierenden Konzentrationen von proinflammatorischen Zytokinen und des Tiergewichts bewertet. Es gibt viele Methoden, um die In-vivo-Toxizität von Arzneimitteln zu bestimmen. Die am weitesten verbreiteten Methoden umfassen jedoch die Messung von Serumenzymen auf Organtoxizität und histologische Veränderungen in diesen Organen. Um histologische Analysen durchführen zu können, muss das Tier jedoch getötet werden, was sich auf die Überlebenskurven des Experiments auswirkt. Daher wird dieses Protokoll ein Protokoll für die Entnahme von Blut von lebenden Mäusen zur Messung von Zytokinen in Serumproben enthalten. Das gesammelte Serum kann für die Messung beliebiger Serumanalyten auf Organtoxizität verwendet werden. Die Multicolor-Durchflusszytometrie wird verwendet, um die Veränderungen in der Immunzellpopulation in der Tumormikroumgebung und die Migration von Immunzellen in den Lymphknoten zu verstehen. Andere Methoden können verwendet werden, um Immunzellen zu identifizieren, einschließlich Immunhistochemie und/oder Immunfluoreszenz von konservierten Abschnitten14. Diese Techniken können jedoch zeitaufwendig und mühsam sein, um sie bei einer großen Anzahl von Tieren durchzuführen. Insgesamt werden die folgenden Methoden es den Forschern ermöglichen, die Antitumor-Immunantwort und mögliche Mechanismen von Immunstimulanzien für die Krebsbehandlung zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wird es jedem Forscher ermöglichen, die Antitumoraktivität und einige der zugrunde liegenden Mechanismen von immunmodulatorischen Medikamenten in einem In-vivo-Tumor-Mausmodellsystem zu untersuchen. Hier wurde ein syngenes subkutanes Tumormodell verwendet, das mehrere Vorteile gegenüber Orthotopenmodellen aufweist, darunter ein technisch einfaches Protokoll, eine einfache Überwachung des Tumorwachstums, eine geringere Morbidität bei Tieren und eine höhere Produzierbarkeit. Subkutane Tumor…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Merit Review Award #I01BX004829 aus den Vereinigten Staaten (U.S.) Department of Veterans Affairs, Biomedical Laboratory Research and Development Service und unterstützt durch das Mezhir Award Program durch das Holden Comprehensive Cancer Center an der University of Iowa.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Riferimenti
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
