הערכת הפעילות האנטי-סרטנית In vivo של ננו-חלקיקים פוליאנהידריד IL-1α
Summary
פרוטוקול סטנדרטי מתואר כדי לחקור את הפעילות האנטי-סרטנית ואת הרעילות הנלווית של IL-1α במודל עכבר סינגני של HNSCC.
Abstract
טיפול בציטוקינים הוא אסטרטגיה אימונותרפית מבטיחה שיכולה לייצר תגובות חיסוניות חזקות נגד גידולים בחולי סרטן. הציטוקין הפרו-דלקתי אינטרלוקין-1 אלפא (IL-1α) הוערך כחומר אנטי-סרטני במספר מחקרים פרה-קליניים וקליניים. עם זאת, רעילות המגבילה מינון, כולל תסמינים דמויי שפעת ולחץ דם נמוך, הפחיתו את ההתלהבות מאסטרטגיה טיפולית זו. העברה מבוססת ננו-חלקיקי פוליאנהידריד (NP) של IL-1α תייצג גישה יעילה בהקשר זה, שכן הדבר עשוי לאפשר שחרור איטי ומבוקר של IL-1α באופן מערכתי תוך הפחתת תופעות לוואי רעילות. כאן מתואר ניתוח הפעילות האנטי-סרטנית של NPs פוליאנהידרידים טעונים IL-1α במודל עכבר סינגני של קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC). תאי אפיתל מורין אורופרינגיאליים המבטאים ביציבות HPV16 E6/E7 יחד עם תאי hRAS ולוציפראז (mEERL) הוזרקו תת עורית לאגף הימני של עכברי C57BL/6J. ברגע שהגידולים הגיעו ל-3-4 מ”מ לכל כיוון, 1.5% IL-1a – טעון 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) ננו-חלקיקים (IL-1α-NP) נוסחה ניתנה לעכברים תוך צפקית. גודל הגידול ומשקל גופו נמדדו ברציפות עד שגודל הגידול או הירידה במשקל הגיעו לקריטריונים של המתת חסד. דגימות דם נלקחו כדי להעריך תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות על ידי ניקור תת-מנדיבולרי, וציטוקינים דלקתיים נמדדו באמצעות בדיקות מולטיפלקס ציטוקינים. בלוטות הגידול והלימפה המפשעתית נכרתו והומוגנו לתרחיף חד-תאי כדי לנתח תאים חיסוניים שונים באמצעות ציטומטריית זרימה מרובת צבעים. שיטות סטנדרטיות אלה יאפשרו לחוקרים לחקור את התגובה החיסונית נגד הגידול ואת המנגנון הפוטנציאלי של NPs immunostimulatory וחומרים אימונותרפיים אחרים לטיפול בסרטן.
Introduction
אחד התחומים המתפתחים של אימונותרפיה לסרטן הוא השימוש בציטוקינים דלקתיים כדי להפעיל את מערכת החיסון של החולים נגד תאי הגידול שלהם. מספר ציטוקינים מעודדי דלקת (כלומר, אינטרפרון-אלפא (IFNα), אינטרלוקין-2 (IL-2) ואינטרלוקין-1 (IL-1)) יכולים ליצור חסינות אנטי-סרטנית משמעותית, מה שעורר עניין בחקר התכונות האנטי-סרטניות, כמו גם הבטיחות של תרופות מבוססות ציטוקינים. אינטרלוקין-1 אלפא (IL-1α) בפרט, הוא ציטוקין פרו-דלקתי הידוע כציטוקין הראשי של דלקת1. מאז גילוי ציטוקין זה בסוף שנות השבעים, הוא נחקר כסוכן אנטי סרטני, כמו גם תרופה hematopoietic לטיפול בהשפעות השליליות של כימותרפיה2. במהלך סוף שנות השמונים, נערכו מספר מחקרים פרה-קליניים וקליניים כדי לקבוע את ההשפעות האנטי-סרטניות של IL-1α 3,4,5,6. מחקרים אלה מצאו פעילות אנטי-סרטנית מבטיחה של רקומביננטי IL-1α (rIL-1α) נגד מלנומה, קרצינומה של תאי הכליה וקרצינומה של השחלות. עם זאת, רעילות, כולל חום, בחילות, הקאות, תסמינים דמויי שפעת, ולחץ דם מגביל מינון חמור ביותר נצפו בדרך כלל. למרבה הצער, רעילויות אלה הקשורות למינון הפחיתו את ההתלהבות משימוש קליני נוסף של rIL-1α.
כדי לנסות לטפל בבעיה הקריטית של רעילות בתיווך IL-1α, ייחקרו נוסחאות ננו-חלקיקי פוליאנהידריד (NP) המאפשרות שחרור מבוקר של IL-1α על ידי קינטיקה של שחיקת פני השטח. פורמולציות NP אלה נועדו לקצור את היתרונות של התכונות האנטי-סרטניות של IL-1α תוך הפחתת תופעות לוואי מגבילות מינון7. פוליאנהידרידים הם פולימרים שאושרו על ידי ה-FDA ומתפרקים באמצעות שחיקת פני השטח וכתוצאה מכך שחרור כמעט מסדר אפס של חומרים עטופים 8,9,10,11,12. קופולימרים פוליאנהידרידים אמפיפיליים המכילים 1,8-bis-(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) ו-1,6-bis-(p-carboxyphenoxy) hexane (CPH), דווחו כמערכות אספקה מצוינות עבור מטענים שונים במחקר מבוסס אונקולוגיה ואימונולוגיה 8,12. בפרוטוקול הבא 20:80 CPTEG:CPH NPs טעונים ב-1.5 wt.% rIL-1α (IL-1α-NPs) ישמשו לחקר הפעילות האנטי-סרטנית והרעילות של ציטוקין זה במודל עכברי של HNSCC.
המטרה הכוללת של ההליכים הבאים היא להעריך את הפעילות האנטי-סרטנית של IL-1α-NPs על HNSCCs. ההליכים המתוארים, כולל הערכת צמיחת הגידול והישרדותו, יכולים להיות מיושמים על כל סוכן מווסת חיסון של עניין. הליכים אלה צריכים להתבצע במודל עכבר סינגני עם מערכת חיסון שלמה13 כדי למקסם את הרלוונטיות הקלינית. רעילות IL-1α-NP תוערך גם על ידי מדידת שינויים ברמות במחזור של ציטוקינים מעודדי דלקת ומשקל בעלי חיים. ישנן שיטות רבות לקבוע רעילות סמים in vivo ; עם זאת, השיטות הנפוצות ביותר כוללות מדידה של אנזימים בסרום עבור רעילות איברים ושינויים היסטולוגיים באיברים אלה. עם זאת, כדי לבצע ניתוחים היסטולוגיים, יש להקריב את החיה, מה שישפיע על עקומות ההישרדות של הניסוי. לכן, פרוטוקול זה יכלול פרוטוקול לאיסוף דם מעכברים חיים למדידת ציטוקינים בדגימות בסרום. הסרום שנאסף יכול לשמש למדידה של כל ניתוח סרום רצוי עבור רעילות איברים. ציטומטריית זרימה צבעונית תשמש להבנת השינויים באוכלוסיית תאי החיסון במיקרו-סביבה של הגידול ובנדידת תאי החיסון לבלוטת הלימפה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות לזיהוי תאים חיסוניים, כולל אימונוהיסטוכימיה ו / או אימונופלואורסנציה של סעיפים14 שהשתמרו. עם זאת, טכניקות אלה יכולות להיות זמן רב ומייגע לבצע על מספר רב של בעלי חיים. בסך הכל, השיטות הבאות יאפשרו לחוקרים לחקור את התגובה החיסונית נגד הגידול ואת המנגנונים הפוטנציאליים של חומרים ממריצים חיסוניים לטיפול בסרטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה יאפשר לכל חוקר לחקור את הפעילות האנטי-סרטנית וחלק מהמנגנונים הבסיסיים של תרופות אימונומודולטוריות במערכת מודל עכבר גידול in vivo . כאן נעשה שימוש במודל גידול תת-עורי סינגני, שיש לו מספר יתרונות על פני מודלים אורתוטופיים, כולל פרוטוקול פשוט מבחינה טכנית, ניטור קל של צמיחת הגי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי Merit Review Award #I01BX004829 מארה”ב המחלקה לענייני חיילים משוחררים, שירות מחקר ופיתוח מעבדה ביו-רפואית ונתמכת על ידי תוכנית פרס מז’יר באמצעות מרכז הולדן מקיף לסרטן באוניברסיטת איווה.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Riferimenti
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
