Valutazione dell'attività antitumorale in vivo di nanoparticelle di polianidride IL-1α
Summary
Viene descritto un protocollo standard per studiare l’attività antitumorale e la tossicità associata di IL-1α in un modello murino singeneico di HNSCC.
Abstract
La terapia con citochine è una strategia immunoterapeutica promettente in grado di produrre robuste risposte immunitarie antitumorali nei pazienti oncologici. La citochina proinfiammatoria interleuchina-1 alfa (IL-1α) è stata valutata come agente antitumorale in diversi studi preclinici e clinici. Tuttavia, le tossicità dose-limitanti, compresi i sintomi simil-influenzali e l’ipotensione, hanno smorzato l’entusiasmo per questa strategia terapeutica. La somministrazione di IL-1α basata su nanoparticelle di polianidride (NP) rappresenterebbe un approccio efficace in questo contesto poiché ciò potrebbe consentire un rilascio lento e controllato di IL-1α a livello sistemico, riducendo al contempo gli effetti collaterali tossici. Qui viene descritta un’analisi dell’attività antitumorale delle NP di polianidride caricate con IL-1α in un modello murino singeneico di carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC). Le cellule epiteliali orofaringee murine che esprimono stabilmente HPV16 E6/E7 insieme alle cellule hRAS e luciferasi (mEERL) sono state iniettate per via sottocutanea nel fianco destro dei topi C57BL/6J. Una volta che i tumori hanno raggiunto 3-4 mm in qualsiasi direzione, una formulazione di nanoparticelle 1,8-bis(p-carbossifenossi)-3,6-dioxaottane:1,6-bis(p-carbossifenossi)esano (CPTEG: CPH) caricata 20:80 è stata somministrata ai topi per via intraperitoneale. Le dimensioni del tumore e il peso corporeo sono stati continuamente misurati fino a quando le dimensioni del tumore o la perdita di peso hanno raggiunto i criteri di eutanasia. Sono stati prelevati campioni di sangue per valutare le risposte immunitarie antitumorali mediante venipuntura sottomandibolare e le citochine infiammatorie sono state misurate attraverso saggi multiplex di citochine. I linfonodi tumorali e inguinali sono stati resecati e omogeneizzati in una sospensione unicellulare per analizzare varie cellule immunitarie attraverso la citometria a flusso multicolore. Questi metodi standard consentiranno ai ricercatori di studiare la risposta immunitaria antitumorale e il potenziale meccanismo delle NP immunostimolatorie e di altri agenti immunoterapici per il trattamento del cancro.
Introduction
Una delle aree emergenti dell’immunoterapia del cancro è l’uso di citochine infiammatorie per attivare il sistema immunitario dei pazienti contro le loro cellule tumorali. Diverse citochine proinfiammatorie (cioè interferone-alfa (IFNα), interleuchina-2 (IL-2) e interleuchina-1 (IL-1)) possono montare una significativa immunità antitumorale, che ha generato interesse nell’esplorare le proprietà antitumorali e la sicurezza dei farmaci a base di citochine. L’interleuchina-1 alfa (IL-1α), in particolare, è una citochina proinfiammatoria nota come citochina principale dell’infiammazione1. Dalla scoperta di questa citochina alla fine del 1970, è stato studiato come agente antitumorale e un farmaco ematopoietico per trattare gli effetti negativi della chemioterapia2. Durante la fine del 1980, diversi studi preclinici e clinici sono stati condotti per determinare gli effetti antitumorali di IL-1α 3,4,5,6. Questi studi hanno trovato una promettente attività antitumorale di IL-1α ricombinante (rIL-1α) contro il melanoma, il carcinoma a cellule renali e il carcinoma ovarico. Tuttavia, sono state comunemente osservate tossicità, tra cui febbre, nausea, vomito, sintomi simil-influenzali e ipotensione più gravemente dose-limitante. Sfortunatamente, queste tossicità correlate alla dose hanno smorzato l’entusiasmo per un ulteriore uso clinico di rIL-1α.
Per tentare di affrontare il problema critico delle tossicità mediate da IL-1α, verranno studiate formulazioni di nanoparticelle di polianidride (NP) che consentano il rilascio controllato di IL-1α da parte della cinetica di erosione superficiale. Queste formulazioni NP hanno lo scopo di raccogliere i benefici delle proprietà antitumorali di IL-1α riducendo gli effetti collaterali dose-limitanti7. Le polianidridi sono polimeri approvati dalla FDA che si degradano attraverso l’erosione superficiale con conseguente rilascio quasi nullo di agenti incapsulati 8,9,10,11,12. I copolimeri anfifilici di polianidride contenenti 1,8-bis-(p-carbossifenerossi)-3,6-diossaottano (CPTEG) e 1,6-bis-(p-carbossifensilene) esano (CPH) sono risultati eccellenti sistemi di rilascio per vari carichi utili nella ricerca oncologica e immunologica 8,12. Nel seguente protocollo 20:80 CPTEG:CPH NPs caricati con 1,5% wt.% rIL-1α (IL-1α-NPs) saranno utilizzati per studiare l’attività antitumorale e la tossicità di questa citochina in un modello murino di HNSCC.
L’obiettivo generale delle seguenti procedure è valutare l’attività antitumorale di IL-1α-NPs sugli HNSCC. Le procedure descritte, compresa la valutazione della crescita e della sopravvivenza del tumore, possono essere applicate a qualsiasi agente immunomodulatore di interesse. Queste procedure devono essere eseguite in un modello murino singeneico con un sistema immunitario intatto13 per massimizzare la rilevanza clinica. La tossicità di IL-1α-NP sarà valutata anche misurando le variazioni dei livelli circolanti di citochine proinfiammatorie e del peso animale. Esistono molti metodi per determinare la tossicità dei farmaci in vivo ; Tuttavia, i metodi più utilizzati comportano la misurazione degli enzimi sierici per la tossicità degli organi e i cambiamenti istologici in tali organi. Tuttavia, per eseguire analisi istologiche, l’animale deve essere sacrificato, il che influenzerà le curve di sopravvivenza dell’esperimento. Pertanto, questo protocollo includerà un protocollo per la raccolta di sangue da topi vivi per la misurazione delle citochine nei campioni di siero. Il siero raccolto può essere utilizzato per la misurazione di qualsiasi analita sierico desiderato per la tossicità d’organo. La citometria a flusso multicolore sarà utilizzata per comprendere i cambiamenti nella popolazione di cellule immunitarie nel microambiente tumorale e la migrazione delle cellule immunitarie al linfonodo. Altri metodi possono essere utilizzati per identificare le cellule immunitarie, tra cui l’immunoistochimica e/o l’immunofluorescenza delle sezioni conservate14. Tuttavia, queste tecniche possono richiedere molto tempo e noiose da eseguire su un gran numero di animali. Nel complesso, i seguenti metodi consentiranno ai ricercatori di studiare la risposta immunitaria antitumorale e i potenziali meccanismi degli agenti immunostimolatori per il trattamento del cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo consentirà a qualsiasi ricercatore di studiare l’attività antitumorale e alcuni dei meccanismi alla base dei farmaci immunomodulatori in un sistema modello di topo tumorale in vivo . Qui è stato utilizzato un modello tumorale sottocutaneo singeneico, che presenta diversi vantaggi rispetto ai modelli ortotopici, tra cui il suo protocollo tecnicamente semplice, un facile monitoraggio della crescita tumorale, una minore morbilità animale e una maggiore producibilità. I modelli tumorali sottoc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte dal Merit Review Award #I01BX004829 dagli Stati Uniti (USA). Department of Veterans Affairs, Biomedical Laboratory Research and Development Service e supportato dal Mezhir Award Program attraverso l’Holden Comprehensive Cancer Center presso l’Università dell’Iowa.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Riferimenti
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