폴리안하이드라이드 IL-1α 나노입자의 생체 내 항종양 활성 평가
Summary
표준 프로토콜은 HNSCC의 동종 마우스 모델에서 IL-1α의 항종양 활성 및 관련 독성을 연구하기 위해 설명된다.
Abstract
사이토카인 요법은 암 환자에서 강력한 항종양 면역 반응을 일으킬 수 있는 유망한 면역요법 전략입니다. 전염증성 사이토카인 인터루킨-1 알파(IL-1α)는 여러 전임상 및 임상 연구에서 항암제로 평가되었습니다. 그러나 독감과 유사한 증상 및 저혈압을 포함한 용량 제한 독성은이 치료 전략에 대한 열정을 약화 시켰습니다. IL-1α의 폴리안하이드라이드 나노입자(NP)기반 전달은 독성 부작용을 줄이면서 전신적으로 IL-1α의 느리고 제어된 방출을 허용할 수 있기 때문에 이러한 맥락에서 효과적인 접근 방식을 나타냅니다. 여기에 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 동종 마우스 모델에서 IL-1α-로딩 폴리안하이드라이드 NPs의 항종양 활성의 분석이 설명된다. hRAS 및 루시퍼라아제(mEERL) 세포와 함께 HPV16 E6/E7을 안정적으로 발현하는 뮤린 구인두 상피 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 임의의 방향으로 3-4 mm에 도달하면 1.5% IL-1a-로딩 20:80 1,8-비스(p-카르복시페녹시)-3,6-디옥사옥탄:1,6-비스(p-카르복시페녹시)헥산(CPTEG: CPH) 나노입자 (IL-1α-NP) 제형을 마우스에 복강내 투여하였다. 종양 크기 및 체중은 종양 크기 또는 체중 감소가 안락사 기준에 도달할 때까지 연속적으로 측정하였다. 턱밑 정맥 천자에 의한 항 종양 면역 반응을 평가하기 위해 혈액 샘플을 채취하고, 염증성 사이토 카인을 사이토 카인 다중 분석을 통해 측정했다. 종양 및 사타구니 림프절을 절제하고 단세포 현탁액으로 균질화하여 다색 유세포 분석을 통해 다양한 면역 세포를 분석했습니다. 이러한 표준 방법을 통해 조사자는 암 치료를 위한 면역자극성 NP 및 기타 면역요법제의 항종양 면역 반응 및 잠재적 메커니즘을 연구할 수 있습니다.
Introduction
암 면역 요법의 새로운 영역 중 하나는 염증성 사이토 카인을 사용하여 종양 세포에 대한 환자의 면역 체계를 활성화하는 것입니다. 몇몇 전염증성 사이토카인(즉, 인터페론-알파(IFNα), 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-1(IL-1))은 상당한 항종양 면역을 탑재할 수 있으며, 이는 사이토카인 기반 약물의 안전성뿐만 아니라 항종양 특성을 탐구하는 데 관심을 불러일으켰습니다. 인터루킨-1 알파(IL-1α)는 특히, 염증1의 마스터 사이토카인으로 알려진 전염증성 사이토카인이다. 1970년대 후반에 이러한 사이토카인이 발견된 이래, 항암제뿐만 아니라 항암제로서 화학요법의 부작용을 치료하는 조혈제로 연구되어왔다2. 1980년대 후반에는 IL-1α 3,4,5,6의 항암 효과를 확인하기 위해 여러 전임상 및 임상 연구가 수행되었습니다. 이 연구는 흑색 종, 신장 세포 암종 및 난소 암종에 대한 재조합 IL-1α (rIL-1α)의 유망한 항 종양 활성을 발견했습니다. 그러나 발열, 메스꺼움, 구토, 독감 유사 증상 및 가장 심각한 용량 제한 저혈압을 포함한 독성이 일반적으로 관찰되었습니다. 불행히도, 이러한 용량 관련 독성은 rIL-1α의 추가 임상 사용에 대한 열정을 약화시켰다.
IL-1α 매개 독성의 중요한 문제를 해결하기 위해 표면 침식 동역학에 의한 IL-1α의 제어 방출을 허용하는 폴리안하이드라이드 나노입자(NP) 제형을 조사합니다. 이러한 NP 제형은 용량 제한 부작용을 줄이면서 IL-1α의 항종양 특성의 이점을 얻기 위한것입니다7. 폴리안하이드라이드는 표면 침식을 통해 분해되어 캡슐화된 제제 8,9,10,11,12의 거의 0차 방출을 초래하는 FDA 승인 폴리머입니다. 1,8-비스-(p-카르복시페녹시)-3,6-디옥사옥탄(CPTEG) 및 1,6-비스-(p-카르복시페녹시)헥산(CPH)을 함유하는 양친매성 폴리안하이드라이드 공중합체는 종양학 및 면역학 기반 연구 8,12에서 다양한 페이로드에 대한 우수한 전달 시스템으로 보고되었습니다. 다음 프로토콜 20:80 CPTEG:CPH NP에는 1.5중량% rIL-1α(IL-1α-NP)가 로딩되어 HNSCC의 마우스 모델에서 이 사이토카인의 항종양 활성 및 독성을 연구하는 데 사용됩니다.
다음 절차의 전반적인 목표는 HNSCC에서 IL-1α-NP의 항 종양 활성을 평가하는 것입니다. 종양 성장 및 생존 평가를 포함하여, 기술된 절차는 임의의 관심있는 면역-조절제에 적용될 수 있다. 이러한 절차는 임상적 관련성을 최대화하기 위해 온전한 면역계(13 )를 갖는 동종 마우스 모델에서 수행되어야 한다. IL-1α-NP 독성은 또한 전염증성 사이토카인의 순환 수준 및 동물 체중의 변화를 측정함으로써 평가될 것이다. 생체 내 약물 독성을 결정하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 그러나 가장 널리 사용되는 방법은 장기 독성 및 해당 기관의 조직 학적 변화에 대한 혈청 효소의 측정을 포함합니다. 그러나 조직 학적 분석을 수행하려면 동물을 희생해야하며 이는 실험의 생존 곡선에 영향을 미칩니다. 따라서, 이 프로토콜은 혈청 샘플에서 사이토카인의 측정을 위해 살아있는 마우스로부터 혈액을 수집하기 위한 프로토콜을 포함할 것이다. 수집된 혈청은 장기 독성에 대한 임의의 원하는 혈청 분석물의 측정에 사용될 수 있다. 다색 유세포 분석은 종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 변화와 림프절로의 면역 세포 이동을 이해하는 데 사용됩니다. 면역조직화학 및/또는 보존된 섹션14의 면역형광을 포함하는 면역 세포를 확인하기 위해 다른 방법이 활용될 수 있다. 그러나 이러한 기술은 많은 수의 동물에서 수행하는 데 시간이 많이 걸리고 지루할 수 있습니다. 전반적으로, 다음 방법을 통해 조사자는 암 치료를위한 항 종양 면역 반응 및 면역 자극제의 잠재적 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 모든 연구자가 생체 내 종양 마우스 모델 시스템에서 항종양 활성 및 면역조절 약물의 기본 메커니즘 중 일부를 연구할 수 있도록 합니다. 여기에서는 동종 피하 종양 모델이 사용되었으며, 이는 기술적으로 간단한 프로토콜, 종양 성장의 쉬운 모니터링, 적은 동물 이환율 및 더 높은 생산 가능성을 포함하여 동종 모델에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 피하 종양 모델은 또한…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 미국(미국)의 Merit Review Award #I01BX004829에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 재향 군인회, 생물 의학 실험실 연구 개발 서비스 및 아이오와 대학의 홀든 종합 암 센터를 통한 Mezhir Award 프로그램의 지원.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Riferimenti
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