Avaliação da Atividade Antitumoral In vivo de Nanopartículas de Polianidrido IL-1α
Summary
Um protocolo padrão é descrito para estudar a atividade antitumoral e a toxicidade associada da IL-1α em um modelo singênico de camundongo de HNSCC.
Abstract
A terapia com citocinas é uma estratégia imunoterapêutica promissora que pode produzir respostas imunes antitumorais robustas em pacientes com câncer. A citocina pró-inflamatória interleucina-1 alfa (IL-1α) tem sido avaliada como agente anticancerígeno em vários estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, toxicidades limitantes da dose, incluindo sintomas semelhantes aos da gripe e hipotensão, diminuíram o entusiasmo por essa estratégia terapêutica. A entrega de IL-1α baseada em nanopartículas de polianidrido (NP) representaria uma abordagem eficaz neste contexto, uma vez que isso pode permitir uma liberação lenta e controlada de IL-1α sistemicamente, reduzindo os efeitos colaterais tóxicos. Aqui é descrita uma análise da atividade antitumoral de NPs de polianidrido carregados de IL-1α em um modelo singênico de camundongo com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSCC). Células epiteliais orofaríngeas murinas expressando de forma estável HPV16 E6/E7 juntamente com células hRAS e luciferase (mEERL) foram injetadas por via subcutânea no flanco direito de camundongos C57BL/6J. Uma vez que os tumores atingiram 3-4 mm em qualquer direção, uma formulação de nanopartículas de 1,5% IL-1a – carregado 20:80 1,8-bis(p-carboxifenoxi)-3,6-dioxaoctano:1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano (CPTEG: CPH) (CPH) foi administrado a camundongos por via intraperitoneal. O tamanho do tumor e o peso corporal foram medidos continuamente até que o tamanho do tumor ou a perda de peso atingissem os critérios de eutanásia. Amostras de sangue foram coletadas para avaliar as respostas imunes antitumorais por punção venosa submandibular, e citocinas inflamatórias foram medidas por meio de ensaios multiplex de citocinas. Os linfonodos tumorais e inguinais foram ressecados e homogeneizados em uma suspensão unicelular para analisar várias células imunes através da citometria de fluxo multicolorida. Esses métodos padrão permitirão que os pesquisadores estudem a resposta imune antitumoral e o mecanismo potencial de NPs imunoestimulatórios e outros agentes de imunoterapia para o tratamento do câncer.
Introduction
Uma das áreas emergentes da imunoterapia contra o câncer é o uso de citocinas inflamatórias para ativar o sistema imunológico dos pacientes contra suas células tumorais. Várias citocinas pró-inflamatórias (ou seja, interferon-alfa (IFNα), interleucina-2 (IL-2) e interleucina-1 (IL-1)) podem montar imunidade antitumoral significativa, o que gerou interesse em explorar as propriedades antitumorais, bem como a segurança de medicamentos à base de citocinas. A interleucina-1 alfa (IL-1α), em particular, é uma citocina pró-inflamatória conhecida como citocina mestra da inflamação1. Desde a descoberta dessa citocina no final da década de 1970, ela tem sido investigada como agente anticancerígeno, bem como medicamento hematopoiético para tratar os efeitos negativos da quimioterapia2. Durante o final da década de 1980, vários estudos pré-clínicos e clínicos foram realizados para determinar os efeitos anticancerígenos da IL-1α 3,4,5,6. Esses estudos encontraram atividade antitumoral promissora de IL-1α recombinante (rIL-1α) contra melanoma, carcinoma de células renais e carcinoma de ovário. No entanto, toxicidades, incluindo febre, náuseas, vômitos, sintomas semelhantes aos da gripe e hipotensão limitante da dose mais grave foram comumente observadas. Infelizmente, essas toxicidades relacionadas à dose diminuíram o entusiasmo pelo uso clínico adicional da rIL-1α.
Para tentar abordar a questão crítica das toxicidades mediadas pela IL-1α, serão investigadas formulações de nanopartículas de polianidrido (NP) que permitam a liberação controlada de IL-1α pela cinética de erosão superficial. Essas formulações de NP destinam-se a colher os benefícios das propriedades antitumorais da IL-1α, reduzindo os efeitos colaterais limitantes da dose7. Os polianidridos são polímeros aprovados pela FDA que se degradam através da erosão superficial, resultando na liberação de quase ordem zero de agentes encapsulados 8,9,10,11,12. Copolímeros anfifílicos de polianidrido contendo 1,8-bis-(p-carboxifenoxi)-3,6-dioxaoctano (CPTEG) e 1,6-bis-(p-carboxifenoxi) hexano (CPH), têm sido relatados como excelentes sistemas de entrega para várias cargas úteis em oncologia e pesquisa baseada em imunologia 8,12. No protocolo a seguir, 20:80 NPs CPTEG:CPH carregados com 1,5% em peso rIL-1α (IL-1α-NPs) serão usados para estudar a atividade antitumoral e a toxicidade dessa citocina em um modelo de camundongo de HNSCC.
O objetivo geral dos procedimentos a seguir é avaliar a atividade antitumoral de IL-1α-NPs em HNSCCs. Os procedimentos descritos, incluindo a avaliação do crescimento e sobrevida tumoral, podem ser aplicados a qualquer agente imunomodulador de interesse. Esses procedimentos devem ser realizados em um modelo singênico de camundongo com sistema imunológico intacto13 para maximizar a relevância clínica. A toxicidade da IL-1α-NP também será avaliada medindo mudanças nos níveis circulantes de citocinas pró-inflamatórias e no peso animal. Existem muitos métodos para determinar a toxicidade in vivo da droga; no entanto, os métodos mais utilizados envolvem a medição de enzimas séricas para toxicidade de órgãos e alterações histológicas nesses órgãos. No entanto, para realizar análises histológicas, o animal precisa ser sacrificado, o que afetará as curvas de sobrevivência do experimento. Portanto, este protocolo incluirá um protocolo para a coleta de sangue de camundongos vivos para a medição de citocinas em amostras de soro. O soro coletado pode ser usado para a medição de quaisquer analitos séricos desejados quanto à toxicidade de órgãos. A citometria de fluxo multicolorida será usada para entender as mudanças na população de células imunes no microambiente tumoral e a migração de células imunes para o linfonodo. Outros métodos podem ser utilizados para identificar células imunes, incluindo imuno-histoquímica e/ou imunofluorescência de seções preservadas14. No entanto, essas técnicas podem ser demoradas e tediosas para executar em um grande número de animais. No geral, os seguintes métodos permitirão que os investigadores estudem a resposta imune antitumoral e os mecanismos potenciais de agentes imunoestimulatórios para o tratamento do câncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permitirá que qualquer investigador estude a atividade antitumoral e alguns dos mecanismos subjacentes de drogas imunomoduladoras em um sistema modelo de camundongo tumoral di vivo. Aqui, foi utilizado um modelo de tumor subcutâneo singênico, que apresenta diversas vantagens em relação aos modelos ortotópicos, incluindo seu protocolo tecnicamente simples, fácil monitoramento do crescimento tumoral, menor morbidade animal e maior produtibilidade. Os modelos de tumores subcutâneos também po…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pelo Prêmio de Revisão de Mérito #I01BX004829 dos Estados Unidos (EUA) Departamento de Assuntos de Veteranos, Serviço de Pesquisa e Desenvolvimento de Laboratório Biomédico e apoiado pelo Programa de Prêmio Mezhir através do Holden Comprehensive Cancer Center da Universidade de Iowa.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Riferimenti
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