Evaluación de la actividad antitumoral in vivo de nanopartículas de polianhídrido IL-1α
Summary
Se describe un protocolo estándar para estudiar la actividad antitumoral y la toxicidad asociada de IL-1α en un modelo singénico de ratón de HNSCC.
Abstract
La terapia con citoquinas es una estrategia inmunoterapéutica prometedora que puede producir respuestas inmunitarias antitumorales robustas en pacientes con cáncer. La citoquina proinflamatoria interleucina-1 alfa (IL-1α) se ha evaluado como agente anticancerígeno en varios estudios preclínicos y clínicos. Sin embargo, las toxicidades limitantes de la dosis, incluidos los síntomas similares a la gripe y la hipotensión, han disminuido el entusiasmo por esta estrategia terapéutica. La administración de IL-1α basada en nanopartículas de polianhídrido (NP) representaría un enfoque efectivo en este contexto, ya que esto puede permitir una liberación lenta y controlada de IL-1α sistémicamente al tiempo que reduce los efectos secundarios tóxicos. Aquí se describe un análisis de la actividad antitumoral de NPs de polianhídrido cargados con IL-1α en un modelo de ratón singénico de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). Las células epiteliales orofaríngeas murinas que expresan de manera estable HPV16 E6 / E7 junto con células hRAS y luciferasa (mEERL) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL / 6J. Una vez que los tumores alcanzaron 3-4 mm en cualquier dirección, se administró una formulación de nanopartículas (IL-1α-NP) cargadas con 1,80% de IL-1a (p-carboxifenoxi)-3,6-dioxaoctano:1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano (CPTEG: CPH) cargadas con 1,5% de IL-1a (CPTEG: CPH) a ratones por vía intraperitoneal. El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron continuamente hasta que el tamaño del tumor o la pérdida de peso alcanzaron los criterios de eutanasia. Se tomaron muestras de sangre para evaluar las respuestas inmunes antitumorales mediante venopunción submandibular, y se midieron citocinas inflamatorias mediante ensayos multiplex de citoquinas. Los ganglios linfáticos tumorales e inguinales se resecaron y homogeneizaron en una suspensión unicelular para analizar varias células inmunes a través de citometría de flujo multicolor. Estos métodos estándar permitirán a los investigadores estudiar la respuesta inmune antitumoral y el mecanismo potencial de las NP inmunoestimulantes y otros agentes de inmunoterapia para el tratamiento del cáncer.
Introduction
Una de las áreas emergentes de la inmunoterapia contra el cáncer es el uso de citoquinas inflamatorias para activar el sistema inmunológico de los pacientes contra sus células tumorales. Varias citocinas proinflamatorias (es decir, interferón-alfa (IFNα), interleucina-2 (IL-2) e interleucina-1 (IL-1)) pueden aumentar una inmunidad antitumoral significativa, lo que ha generado interés en explorar las propiedades antitumorales, así como la seguridad de los fármacos basados en citoquinas. La interleucina-1 alfa (IL-1α) en particular, es una citoquina proinflamatoria conocida como la citoquina maestra de la inflamación1. Desde el descubrimiento de esta citoquina a finales de la década de 1970, se ha investigado como un agente anticancerígeno, así como un fármaco hematopoyético para tratar los efectos negativos de la quimioterapia2. A finales de la década de 1980, se realizaron varios estudios preclínicos y clínicos para determinar los efectos anticancerígenos de IL-1α 3,4,5,6. Estos estudios encontraron una actividad antitumoral prometedora de IL-1α recombinante (rIL-1α) contra el melanoma, el carcinoma de células renales y el carcinoma de ovario. Sin embargo, se observaron con frecuencia toxicidades, como fiebre, náuseas, vómitos, síntomas similares a los de la gripe y, más gravemente, hipotensión limitante de la dosis. Desafortunadamente, estas toxicidades relacionadas con la dosis disminuyeron el entusiasmo por un mayor uso clínico de rIL-1α.
Para intentar abordar el problema crítico de las toxicidades mediadas por IL-1α, se investigarán formulaciones de nanopartículas de polianhídrido (NP) que permitan la liberación controlada de IL-1α por cinética de erosión superficial. Estas formulaciones NP están destinadas a cosechar los beneficios de las propiedades antitumorales de IL-1α al tiempo que reducen los efectos secundarios limitantes de la dosis7. Los polianhídridos son polímeros aprobados por la FDA que se degradan a través de la erosión superficial, lo que resulta en una liberación de orden casi cero de agentes encapsulados 8,9,10,11,12. Se ha informado que los copolímeros de polianhídrido anfifílico que contienen 1,8-bis-(p-carboxifenoxi)-3,6-dioxaoctano (CPTEG) y 1,6-bis-(p-carboxifenoxi) hexano (CPH) son excelentes sistemas de administración para diversas cargas útiles en oncología e investigación basada en inmunología 8,12. En el siguiente protocolo 20:80 CPTEG:CPH NPs cargados con 1,5% en peso de rIL-1α (IL-1α-NPs) se utilizarán para estudiar la actividad antitumoral y la toxicidad de esta citoquina en un modelo de ratón de HNSCC.
El objetivo general de los siguientes procedimientos es evaluar la actividad antitumoral de IL-1α-NP en los HNSCC. Los procedimientos descritos, incluida la evaluación del crecimiento y la supervivencia del tumor, se pueden aplicar a cualquier agente inmunomodulador de interés. Estos procedimientos deben realizarse en un modelo de ratón singénico con un sistema inmuneintacto 13 para maximizar la relevancia clínica. La toxicidad de IL-1α-NP también se evaluará midiendo los cambios en los niveles circulantes de citoquinas proinflamatorias y el peso animal. Existen muchos métodos para determinar la toxicidad in vivo de los fármacos; Sin embargo, los métodos más utilizados implican la medición de las enzimas séricas para la toxicidad de los órganos y los cambios histológicos en esos órganos. Sin embargo, para realizar análisis histológicos, el animal necesita ser sacrificado, lo que afectará las curvas de supervivencia del experimento. Por lo tanto, este protocolo incluirá un protocolo para la recolección de sangre de ratones vivos para la medición de citoquinas en muestras de suero. El suero recolectado se puede utilizar para la medición de cualquier analito sérico deseado para la toxicidad de los órganos. La citometría de flujo multicolor se utilizará para comprender los cambios en la población de células inmunitarias en el microambiente tumoral y la migración de células inmunitarias al ganglio linfático. Se pueden utilizar otros métodos para identificar células inmunes, incluyendo inmunohistoquímica y/o inmunofluorescencia de secciones preservadas14. Sin embargo, estas técnicas pueden llevar mucho tiempo y ser tediosas de realizar en un gran número de animales. En general, los siguientes métodos permitirán a los investigadores estudiar la respuesta inmune antitumoral y los posibles mecanismos de los agentes inmunoestimulantes para el tratamiento del cáncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permitirá a cualquier investigador estudiar la actividad antitumoral y algunos de los mecanismos subyacentes de los fármacos inmunomoduladores en un sistema modelo de ratón tumoral in vivo . Aquí, se utilizó un modelo de tumor subcutáneo singénico, que tiene varias ventajas sobre los modelos ortotópicos, incluido su protocolo técnicamente sencillo, fácil monitoreo del crecimiento tumoral, menos morbilidad animal y mayor producibilidad. Los modelos de tumores subcutáneos también se pued…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por el Premio de Revisión al Mérito #I01BX004829 de los Estados Unidos (EE. Departamento de Asuntos de Veteranos, Servicio de Investigación y Desarrollo de Laboratorios Biomédicos y apoyado por el Programa de Premios Mezhir a través del Centro Integral de Cáncer Holden de la Universidad de Iowa.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Riferimenti
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