Utvärdering av in vivo antitumöraktivitet av polyanhydrid IL-1α nanopartiklar
Summary
Ett standardprotokoll beskrivs för att studera antitumöraktiviteten och associerad toxicitet av IL-1α i en syngen musmodell av HNSCC.
Abstract
Cytokinbehandling är en lovande immunterapeutisk strategi som kan producera robusta antitumörimmunsvar hos cancerpatienter. Det proinflammatoriska cytokinet interleukin-1 alfa (IL-1α) har utvärderats som ett anticancermedel i flera prekliniska och kliniska studier. Dosbegränsande toxiciteter, inklusive influensaliknande symtom och hypotoni, har dock dämpat entusiasmen för denna terapeutiska strategi. Polyanhydridnanopartikel (NP)-baserad leverans av IL-1α skulle utgöra ett effektivt tillvägagångssätt i detta sammanhang eftersom detta kan möjliggöra en långsam och kontrollerad frisättning av IL-1α systemiskt samtidigt som toxiska biverkningar minskas. Här beskrivs en analys av antitumöraktiviteten hos IL-1α-laddade polyanhydrid NPs i en syngen musmodell med skivepitelcancer (HNSCC) i huvud och hals. Murina orofaryngeala epitelceller som stabilt uttrycker HPV16 E6/E7 tillsammans med hRAS- och luciferasceller (mEERL) injicerades subkutant i den högra flanken av C57BL/6J-möss. När tumörer nådde 3-4 mm i vilken riktning som helst, administrerades en 1,5% IL-1a – laddad 20:80 1,8-bis (p-karboxifenoxi) -3,6-dioxaoktan: 1,6-bis (p-karboxifenoxi) hexan (CPTEG: CPH) nanopartikel (IL-1a-NP) formulering till möss intraperitonealt. Tumörstorlek och kroppsvikt mättes kontinuerligt tills tumörstorlek eller viktminskning nådde eutanasikriterier. Blodprover togs för att utvärdera antitumörimmunsvar genom submandibulär venipunktur och inflammatoriska cytokiner mättes genom cytokinmultiplexanalyser. Tumör- och inguinala lymfkörtlar resekterades och homogeniserades till en encellssuspension för att analysera olika immunceller genom flerfärgad flödescytometri. Dessa standardmetoder gör det möjligt för utredare att studera antitumörimmunsvaret och den potentiella mekanismen för immunstimulerande NP och andra immunterapimedel för cancerbehandling.
Introduction
Ett av de framväxande områdena inom cancerimmunterapi är användningen av inflammatoriska cytokiner för att aktivera patienternas immunförsvar mot deras tumörceller. Flera proinflammatoriska cytokiner (dvs interferon-alfa (IFNα), interleukin-2 (IL-2) och interleukin-1 (IL-1)) kan montera signifikant antitumörimmunitet, vilket har genererat intresse för att utforska antitumöregenskaperna såväl som säkerheten hos cytokinbaserade läkemedel. Interleukin-1 alfa (IL-1a) i synnerhet är ett proinflammatoriskt cytokin som kallas mastercytokin för inflammation1. Sedan upptäckten av detta cytokin i slutet av 1970-talet har det undersökts som ett anticancermedel samt ett hematopoetiskt läkemedel för att behandla de negativa effekterna av kemoterapi2. Under slutet av 1980-talet genomfördes flera prekliniska och kliniska studier för att bestämma anticancereffekterna av IL-1α 3,4,5,6. Dessa studier fann lovande antitumöraktivitet av rekombinant IL-1α (rIL-1α) mot melanom, njurcellscancer och äggstockscancer. Toxicitet, inklusive feber, illamående, kräkningar, influensaliknande symtom och allvarligast dosbegränsande hypotoni observerades emellertid. Tyvärr dämpade dessa dosrelaterade toxiciteter entusiasmen för ytterligare klinisk användning av rIL-1α.
För att försöka ta itu med den kritiska frågan om IL-1a-medierad toxicitet kommer polyanhydridnanopartikelformuleringar (NP) som möjliggör kontrollerad frisättning av IL-1α genom yterosionskinetik att undersökas. Dessa NP-formuleringar är avsedda att skörda fördelarna med antitumöregenskaperna hos IL-1α samtidigt som dosbegränsande biverkningar minskas7. Polyanhydrider är FDA-godkända polymerer som bryts ned genom yterosion vilket resulterar i nästan nollorderfrisättning av inkapslade medel 8,9,10,11,12. Amfifila polyanhydridsampolymerer innehållande 1,8-bis-(p-karboxifenoxi)-3,6-dioxaoktan (CPTEG) och 1,6-bis-(p-karboxifenoxi) hexan (CPH), har rapporterats vara utmärkta leveranssystem för olika nyttolaster inom onkologi och immunologibaserad forskning 8,12. I följande protokoll 20:80 CPTEG: CPH NPs laddade med 1.5 vikt% rIL-1α (IL-1a-NPs) kommer att användas för att studera antitumöraktiviteten och toxiciteten hos detta cytokin i en musmodell av HNSCC.
Det övergripande målet med följande procedurer är att bedöma antitumöraktiviteten hos IL-1a-NP på HNSCC. De beskrivna förfarandena, inklusive bedömning av tumörtillväxt och överlevnad, kan tillämpas på alla immunmodulerande medel av intresse. Dessa procedurer bör utföras i en syngen musmodell med ett intakt immunsystem13 för att maximera klinisk relevans. IL-1α-NP-toxicitet kommer också att bedömas genom att mäta förändringar i cirkulerande nivåer av proinflammatoriska cytokiner och djurvikt. Det finns många metoder för att bestämma in vivo läkemedelstoxicitet; De mest använda metoderna innefattar emellertid mätning av serumenzymer för organtoxicitet och histologiska förändringar i dessa organ. Men för att utföra histologiska analyser måste djuret offras, vilket kommer att påverka experimentets överlevnadskurvor. Därför kommer detta protokoll att innehålla ett protokoll för insamling av blod från levande möss för mätning av cytokiner i serumprover. Det insamlade serumet kan användas för mätning av önskade serumanalyter med avseende på organtoxicitet. Multicolor flow cytometri kommer att användas för att förstå förändringarna i immuncellspopulationen i tumörmikromiljön och immuncellsmigration till lymfkörteln. Andra metoder kan användas för att identifiera immunceller, inklusive immunhistokemi och/eller immunofluorescens av bevarade avsnitt14. Dessa tekniker kan dock vara tidskrävande och tråkiga att utföra på ett stort antal djur. Sammantaget kommer följande metoder att göra det möjligt för utredare att studera antitumörimmunsvaret och potentiella mekanismer för immunstimulerande medel för cancerbehandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll gör det möjligt för alla prövare att studera antitumöraktiviteten och några av de underliggande mekanismerna för immunmodulerande läkemedel i ett in vivo tumörmusmodellsystem. Här användes en syngen subkutan tumörmodell, som har flera fördelar jämfört med ortotopiska modeller, inklusive dess tekniskt enkla protokoll, enkel övervakning av tumörtillväxt, mindre djursjuklighet och högre producerbarhet. Subkutana tumörmodeller kan också modifieras till en bilateral tumörmodell g…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av Merit Review Award #I01BX004829 från USA (USA) Department of Veterans Affairs, Biomedical Laboratory Research and Development Service och stöds av Mezhir Award Program genom Holden Comprehensive Cancer Center vid University of Iowa.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Riferimenti
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
