Polianhidrit IL-1α Nanopartiküllerinin In vivo Antitümör Aktivitesinin Değerlendirilmesi
Summary
HNSCC’nin sinjenik fare modelinde IL-1α’nın antitümör aktivitesini ve ilişkili toksisitesini incelemek için standart bir protokol tanımlanmıştır.
Abstract
Sitokin tedavisi, kanser hastalarında sağlam antitümör immün yanıtları üretebilen umut verici bir immünoterapötik stratejidir. Proinflamatuar sitokin interlökin-1 alfa (IL-1α) birçok preklinik ve klinik çalışmada antikanser ajanı olarak değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, grip benzeri semptomlar ve hipotansiyon da dahil olmak üzere doz sınırlayıcı toksisiteler, bu terapötik stratejiye olan coşkuyu azaltmıştır. IL-1α’nın polianhidrit nanopartikül (NP) bazlı verilmesi, bu bağlamda etkili bir yaklaşımı temsil edecektir, çünkü bu, toksik yan etkileri azaltırken IL-1α’nın sistemik olarak yavaş ve kontrollü bir şekilde salınmasına izin verebilir. Burada, IL-1α yüklü polianhidrit NP’lerin baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC) sinjenik fare modelindeki antitümör aktivitesinin bir analizi açıklanmaktadır. HPV16 E6/E7’yi kararlı bir şekilde eksprese eden murin orofaringeal epitel hücreleri, hRAS ve lusiferaz (mEERL) hücreleri ile birlikte C57BL/6J farelerinin sağ kanadına deri altından enjekte edildi. Tümörler herhangi bir yönde 3-4 mm’ye ulaştığında, farelere intraperitoneal olarak %1,5 IL-1a – yüklü 20:80 1,8-bis (p-karboksifenoksi)-3,6-dioksaoktan:1,6-bis(p-karboksifenoksi)hekzan (CPTEG: CPH) nanopartikül (IL-1α-NP) formülasyonu uygulandı. Tümör boyutu ve vücut ağırlığı, tümör boyutu veya kilo kaybı ötenazi kriterlerine ulaşana kadar sürekli olarak ölçüldü. Submandibuler venipunktur ile antitümör immün yanıtları değerlendirmek için kan örnekleri alındı ve sitokin multipleks tahlilleri ile inflamatuar sitokinler ölçüldü. Tümör ve inguinal lenf nodları rezeke edildi ve çok renkli akış sitometrisi ile çeşitli immün hücreleri analiz etmek için tek hücreli bir süspansiyona homojenize edildi. Bu standart yöntemler, araştırmacıların antitümör immün yanıtını ve immünostimülatör NP’lerin ve kanser tedavisi için diğer immünoterapi ajanlarının potansiyel mekanizmasını incelemelerine izin verecektir.
Introduction
Kanser immünoterapisinin ortaya çıkan alanlarından biri, hastaların bağışıklık sistemini tümör hücrelerine karşı aktive etmek için enflamatuar sitokinlerin kullanılmasıdır. Birkaç proinflamatuar sitokin (yani, interferon-alfa (IFNa), interlökin-2 (IL-2) ve interlökin-1 (IL-1)), antitümör özelliklerin yanı sıra sitokin bazlı ilaçların güvenliğini keşfetmeye ilgi duyan önemli antitümör bağışıklığı oluşturabilir. Özellikle interlökin-1 alfa (IL-1α), inflamasyonun ana sitokini olarak bilinen proinflamatuar bir sitokindir1. 1970’lerin sonlarında bu sitokinin keşfinden bu yana, kemoterapinin olumsuz etkilerini tedavi etmek için bir antikanser ajanı ve hematopoetik bir ilaç olarak araştırılmıştır2. 1980’lerin sonlarında, IL-1α 3,4,5,6’nın antikanser etkilerini belirlemek için çeşitli klinik öncesi ve klinik çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalar, melanom, renal hücreli karsinom ve yumurtalık karsinomuna karşı rekombinant IL-1α’nın (rIL-1α) umut verici antitümör aktivitesini bulmuştur. Bununla birlikte, ateş, bulantı, kusma, grip benzeri semptomlar ve en ciddi doz sınırlayıcı hipotansiyon gibi toksisiteler yaygın olarak gözlenmiştir. Ne yazık ki, dozla ilişkili bu toksisiteler, rIL-1α’nın daha ileri klinik kullanımı için coşkuyu azaltmıştır.
IL-1α aracılı toksisitelerin kritik sorununu ele almaya çalışmak için, IL-1α’nın yüzey erozyon kinetiği ile kontrollü salınımına izin veren polianhidrit nanopartikül (NP) formülasyonları araştırılacaktır. Bu NP formülasyonları, IL-1α’nın antitümör özelliklerinin faydalarını elde etmeyi ve doz sınırlayıcı yan etkileri azaltmayı amaçlamaktadır7. Polianhidritler, yüzey erozyonu yoluyla parçalanan ve kapsüllenmiş ajanların 8,9,10,11,12 oranında neredeyse sıfır dereceli salınımına neden olan FDA onaylı polimerlerdir. 1,8-bis-(p-karboksifenoksi)-3,6-dioksaoktan (CPTEG) ve 1,6-bis-(p-karboksifenoksi) hekzan (CPH) içeren amfifilik polianhidrit kopolimerlerinin, onkoloji ve immünoloji temelli araştırmalarda çeşitli yükler için mükemmel dağıtım sistemleri olduğu bildirilmiştir 8,12. Aşağıdaki protokolde 20:80 CPTEG:Ağırlıkça% 1.5 rIL-1α (IL-1α-NP’ler) ile yüklü CPH NP’ler, HNSCC’nin bir fare modelinde bu sitokinin antitümör aktivitesini ve toksisitesini incelemek için kullanılacaktır.
Aşağıdaki prosedürlerin genel amacı, IL-1α-NP’lerin HNSCC’ler üzerindeki antitümör aktivitesini değerlendirmektir. Tümör büyümesinin ve sağkalımının değerlendirilmesi de dahil olmak üzere tarif edilen prosedürler, ilgilenilen herhangi bir immün modülatör ajana uygulanabilir. Bu prosedürler, klinik alaka düzeyini en üst düzeye çıkarmak için sağlam bir bağışıklık sistemi13 olan sinjenik bir fare modelinde yapılmalıdır. IL-1α-NP toksisitesi, dolaşımdaki proinflamatuar sitokin seviyelerindeki ve hayvan ağırlığındaki değişiklikleri ölçerek de değerlendirilecektir. İn vivo ilaç toksisitesini belirlemek için birçok yöntem vardır; Bununla birlikte, en yaygın kullanılan yöntemler, serum enzimlerinin organ toksisitesi ve bu organlardaki histolojik değişiklikler açısından ölçülmesini içerir. Bununla birlikte, histolojik analizler yapmak için, hayvanın kurban edilmesi gerekir, bu da deneyin hayatta kalma eğrilerini etkileyecektir. Bu nedenle, bu protokol, serum örneklerinde sitokinlerin ölçümü için canlı farelerden kan toplanması için bir protokol içerecektir. Toplanan serum, organ toksisitesi için istenen serum analitlerinin ölçümü için kullanılabilir. Çok renkli akım sitometrisi, tümör mikroortamındaki immün hücre popülasyonundaki değişiklikleri ve lenf noduna immün hücre göçünü anlamak için kullanılacaktır. İmmün hücreleri tanımlamak için, korunmuş bölüm14’ün immünohistokimyası ve / veya immünofloresansı dahil olmak üzere diğer yöntemler kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler çok sayıda hayvan üzerinde gerçekleştirmek için zaman alıcı ve sıkıcı olabilir. Genel olarak, aşağıdaki yöntemler araştırmacıların antitümör immün yanıtını ve kanser tedavisi için immünostimülatör ajanların potansiyel mekanizmalarını incelemelerine izin verecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, herhangi bir araştırmacının antitümör aktivitesini ve immünomodülatör ilaçların altta yatan mekanizmalarından bazılarını in vivo tümör fare modeli sisteminde incelemesine izin verecektir. Burada, teknik olarak basit protokolü, tümör büyümesinin kolay izlenmesi, daha az hayvan morbiditesi ve daha yüksek üretilebilirlik dahil olmak üzere ortotopik modellere göre çeşitli avantajları olan sinjenik bir subkutan tümör modeli kullanılmıştır. Subkutan tümör modelleri, he…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Amerika Birleşik Devletleri’nden (ABD) Merit Review Award #I01BX004829 tarafından desteklenmiştir. Gazi İşleri Bölümü, Biyomedikal Laboratuvar Araştırma ve Geliştirme Hizmeti ve Iowa Üniversitesi’ndeki Holden Kapsamlı Kanser Merkezi aracılığıyla Mezhir Ödül Programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
Riferimenti
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
