脳と脊椎を組み合わせた手術を用いた二重ウイルスベクターによる新生児ラットの皮質脊髄路の標的化
Summary
このプロトコルは、順行性化学遺伝修飾剤を体性運動皮質に注入し、逆行性に輸送可能なCreリコンビナーゼを頸髄に注射することにより、生後5〜10日の新生児ラットの細胞の亜集団に遺伝子治療を適用するための新しい方法を示しています。
Abstract
新生児ラットの研究を制約する障害にうまく取り組むことは、成人のSCIと比較した小児脊髄損傷(SCI)で見られる結果の違いを研究するために重要です。さらに、中枢神経系(CNS)の標的細胞に治療法を確実に導入することは困難な場合があり、不正確さは研究または治療の有効性を損なう可能性があります。このプロトコルは、ウイルスベクター技術と新しい外科技術を組み合わせて、出生後5日目に新生児ラットに遺伝子治療を正確に導入します。ここでは、Creの逆行性輸送(retroAAV2)のために設計されたウイルスが脊髄の皮質脊髄ニューロンの軸索終末に導入され、そこで細胞体に輸送されます。次に、デザイナードラッグ(DREADD)ウイルスによって排他的に活性化された二重フロックス逆方位(DIO)デザイナー受容体が脳の体性運動皮質に注入されます。この二重感染技術は、同時感染した皮質脊髄路(CST)ニューロンでのみDREADDの発現を促進します。したがって、体性運動皮質と頸部CST終末の同時同時注射は、新生児ラットにおける子宮頸部SCIモデル後の回復の化学遺伝学的調節を研究するための有効な方法です。
Introduction
SCIは小児集団では比較的まれな発生ですが、特に外傷性であり、計り知れないロジスティックの先見性を必要とする永続的な障害を引き起こします。さらに、小児SCIの割合は、成人集団と比較して子宮頸部および完全として分類されます1,2。哺乳類種の特徴は、新生児が成人よりもSCIから著しくよく回復することであり、これは若い集団の回復のための推進メカニズムを評価する機会を提供します3,4,5。それにもかかわらず、新生児および乳児のげっ歯類の研究に取り組むマルチモーダル研究は少なく、若い動物のはるかに狭い解剖学的ランドマークにあるニューロンの選択された集団を正確に標的にすることの難しさが加わったこともあり6。この記事では、高効率の順行性および逆行性アデノ関連ベクターをラット脊髄に直接注入して、Cre依存性DREADDの適用により主要な運動経路を調節し、マルチモーダル再生研究の範囲を拡大することに焦点を当てています。
ウイルスベクターは、標的遺伝子の代替、成長タンパク質のアップレギュレーション、CNS 7,8,9の解剖学的景観の追跡のための遺伝物質の導入など、幅広い用途を持つ重要な生物学的ツールです。脊髄運動経路の解剖学的詳細の多くは、古典的なトレーサー、すなわちビオチン化デキストランアミンを使用して研究されてきました。従来のトレーサーは神経解剖学の発掘に役立ってきましたが、正しく注射されても経路を無差別に標識し、損傷した軸索に取り込まれることが研究によって発見されています10,11,12。その結果、これは、切断された軸索が再生繊維と間違われる可能性のある再生研究における誤った解釈につながる可能性があります。
以下の方法は、調節研究において最近普及した2ウイルスベクターシステムを利用し、同じニューロン13、14の2つの別々の領域に2つの異なるウイルスベクターを有する。1つ目は、投射ニューロンの細胞体に局所的に感染するベクターです。もう一つは、投射ニューロンの軸索終末から輸送される逆行性ベクターです(図1)。逆行性ベクターはCreリコンビナーゼを担持し、局所ベクターは蛍光タンパク質(mCherry)がコードされる「Cre-On」ダブルフロックス配列を組み込んでいます。hM3DqとmCherryの両方を発現する天然導入遺伝子は、プロモーターに対して反転しており、2つのLoxPサイトに隣接しています(図2)。したがって、mCherryは、CreリコンビナーゼがLoxPサイト間の組換えイベントを誘発し、導入遺伝子の向きを適切な読み取りフレームに切り替え、DREADDと蛍光タンパク質の両方の発現を可能にする二重形質導入投影ニューロンでのみ発現されます。ウイルス導入遺伝子が正しい方向になると、そして該当する場合、DREADDは、別々に注入されたリガンド、すなわちクロザピン-N-オキシドを介して神経調節を一時的に誘導することができる。このプロトコルは、新生児における誘導性神経調節研究を認証するために設計されており、DREADDSが注入されてCSTを選択的に調節します。2ウイルスシステムは保険契約として機能し、すべてのDREAD陽性細胞が蛍光下で高い忠実度で追跡可能であり、注射を検証します。
この方法は、新生児研究のギャップを埋めるのにも役立ちます。小児SCIには課題があり、再生、発芽、または可塑性を分析する研究では、新生児と成人の違いを強調する必要があります3,15,16,17。外科的処置を最適化し、Nissl染色による事前の解剖学的研究を実施することにより、頭蓋注射と脊椎注射の両方の座標が検証されました。目的は、忠実度と生存率を高めた新生児ラットへの二重注射の方法を提供することでした。
現在のモデルでは、順行性ベクターを、参照18,19としてブレグマを使用して体性運動皮質の細胞体に注入しました。脊椎注射に関しては、逆行性ベクターを、CST軸索終末が存在する椎弓板V-VIIに注入した20,21。特定の病変モデルが若い動物に異なる影響を与える方法、およびその後の回復が年配の動物からどのように分岐するかの根底には多くの基本的な質問があります。この研究は、新生児げっ歯類の頸部損傷と前肢機能の回復可能性を研究するための強力な手段を示しています。対照的に、以前の研究の大部分は、腰椎または胸部の損傷後の回復運動に取り組んできました5,22,23,24。二重ウイルスベクターをここで説明する新しい注射技術と組み合わせることにより、このプロトコルは、新生児げっ歯類の調査を悩ませる可能性のある特定の問題(つまり、生存可能性)を軽減するのに役立ちます。この方法は堅牢で実用的で汎用性があり、技術のわずかなバリエーションにより、腹側CST、背側CST、および上行背側経路など、さまざまな経路を標的にすることができます。
このシステムのために、1つの局所作用型ウイルス(例えば、AAV2)が、目的のニューロン細胞体の領域に注入される。局所ウイルスの発現を制御する第2の逆行性に輸送されるウイルスは、そのニューロン集団の軸索終末に注射される。したがって、定義上、皮質脊髄ニューロンのみが標識される。シャトルプラスミドを使用して、いくつかの細胞型でCre依存性発現のためのいくつかのAAV血清型を生成するために使用されるため、retroAAV-Creウイルスは構成的に活性なCMVプロモーターで選択されました。皮質注射の場合、AAV2は、シナプシン-1プロモーターによって駆動される導入遺伝子で選択され、発現をニューロンに制限しました。2ウイルス系は、関心のあるニューロン集団の起源と終結に大きく依存しているため、関心のあるニューロン集団内で目的の遺伝子の発現を駆動できる場合は、いくつかの異なるプロモーターを使用できます。例えば、興奮性ニューロンプロモーターであるCamKIIは、シナプシン-1の代わりになり得る。これらのAAV血清型の使用に加えて、未熟への逆行性輸送、およびはるかに少ない程度で、成人の皮質脊髄運動ニューロンも、高逆行性輸送可能なレンチウイルス(HiRet)を使用して達成できます25。HiRetレンチウイルスは、キメラ狂犬病/VSV糖タンパク質を使用して、逆行性輸送のためにシナプスでの取り込みを標的にします。Tet-Onプロモーターと組み合わせると、この2ウイルス系は逆行依存的に誘導可能な発現をサポートします26,27。
逆行性ウイルスは、標的ニューロンのシナプス空間にベクターを挿入し、その細胞の軸索に取り込まれて細胞体に輸送されるようにします。レンチウイルスベクターはこれまで大きな成功を収めており、遺伝子治療研究で長期的な発現を提供していましたが、この方法はいくつかの単純な理由でアデノ随伴ウイルスベクターに軸足を移しました26,28:AAVは、バイオセーフティレベルの指定が低いことを考えると、より経済的で、同様に効果的であり、ロジスティックの負担が少ない29,30,31,32.最も使用されている血清型であるAAV2は、CST軸索の堅牢なトランスフェクションを示していますが、将来の研究者は、AAV1が経鼻発作で標識するため、ある程度の汎用性を提供することに気付く可能性があり、したがって、将来の研究でいくつかの可能な反復を提示します33。最終的な適応は、複数の順行性ベクターを同時に導入できるように、逆行性ウイルスをCre-リコンビナーゼでコードし、それによって不要な社内ウイルス廃棄物を減らし、DREADDが正しい方向に発現する可能性を最大化することです。
最終的に、このプロトコルは、皮質と頸椎への同時注射を示し、特に皮質脊髄路の細胞体と軸索終末をそれぞれ標的にします。ハイフィデリティトランスフェクションは大脳皮質と脊髄に見られます。記載されているプロトコルは、5日齢のSprague Dawleyラット用に完成されましたが、麻酔と定位座標をわずかに調整した生後4〜10日目に適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
注射可能な化学遺伝学的修飾因子による脳活動の誘導的遺伝的調節は、SCIからの回復の根底にあるさまざまなメカニズムを研究する上で強力なツールです。誘導性Gタンパク質共役型受容体(DREADD)のターゲティングの精度は、蛍光トレースが組織学における解剖学的精度を検証することを考慮するとさらに向上します。この論文では、選択されたニューロン経路(興奮性または抑制性のDREADDSの?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、シュラインズ小児病院SHC-84706からのフェローシップ助成金によって資金提供されました。
Materials
| #11 scalpel blades | Roboz | RS-9801-11 | For use with the scalpel. |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic SC injection and fluid bolus |
| 4.0 silk suture | Ethicon | 771-683G | For skin closure |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation |
| Ketamine (Ketaset) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51600 | To hold the neonatal sterotaxic holder in place |
| Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor | 51615 | For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections | |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Cre plasmid | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361) | Bryan Roth’s lab through Addgene | DREADD plasmid | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
| Liquid bandage | NewSkin | 985838 | To apply along sutures following surgery and encourage wound healing |
| Wire Cage Lamp | ZooMed | LF10EC | To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally |
Riferimenti
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