Cibler le tractus corticospinal chez les rats néonatals avec un vecteur double viral à l’aide d’une chirurgie combinée du cerveau et de la colonne vertébrale

Summary

Ce protocole démontre une nouvelle méthode d’application de thérapies géniques à des sous-populations de cellules chez des rats néonatals âgés de 5 à 10 jours après la naissance en injectant un modificateur chimiogénétique antérograde dans le cortex somatomoteur et une Cre recombinase rétrogradablement transportable dans la moelle épinière cervicale.

Abstract

Il est important de s’attaquer avec succès aux obstacles qui entravent la recherche sur les rats nouveau-nés pour étudier les différences dans les résultats observés dans les lésions de la moelle épinière (LME) pédiatriques par rapport aux lésions médullaires adultes. En outre, l’introduction fiable de thérapies dans les cellules cibles du système nerveux central (SNC) peut être difficile, et les inexactitudes peuvent compromettre l’efficacité de l’étude ou de la thérapie. Ce protocole combine la technologie des vecteurs viraux avec une nouvelle technique chirurgicale pour introduire avec précision des thérapies géniques chez les rats nouveau-nés au 5e jour postnatal. Ici, un virus conçu pour le transport rétrograde (rétroAAV2) de Cre est introduit aux terminaisons axonales des neurones corticospinaux de la moelle épinière, où il est ensuite transporté vers les corps cellulaires. Un récepteur concepteur à double flox à orientation inversée (DIO) exclusivement activé par le virus DREADD (drogue(s) de synthèse (DREADD) est ensuite injecté dans le cortex somatomoteur du cerveau. Cette technique de double infection favorise l’expression des DREADDs uniquement dans les neurones cortico-infectés (CST). Ainsi, la co-injection simultanée du cortex somatomoteur et des terminaux CST cervicaux est une méthode valide pour étudier la modulation chimiogénétique de la récupération à la suite de modèles de lésions médullaires cervicales chez le rat nouveau-né.

Introduction

Bien que l’ICS soit relativement rare dans la population pédiatrique, elle est particulièrement traumatisante et entraîne une invalidité permanente nécessitant une immense prévoyance logistique. De plus, une proportion plus élevée de lésions médullaires pédiatriques est classée comme cervicale et complète par rapport à la population adulte ^1,2. Une caractéristique des espèces de mammifères est que les nouveau-nés se rétablissent nettement mieux de la lésion médullaire que les adultes, ce qui offre l’occasion d’évaluer les mécanismes moteurs du rétablissement dans les populations plus jeunes ^3,4,5. Malgré cela, il y a moins d’études multimodales abordant la recherche sur les rongeurs nouveau-nés et infantiles, en partie en raison de la difficulté supplémentaire de cibler avec précision certaines populations de neurones dans les repères anatomiques beaucoup plus serrés des jeunes animaux⁶. Cet article se concentre sur l’injection directe de vecteurs adéno-associés antérogrades et rétrogrades hautement efficaces dans la moelle épinière du rat pour moduler les principales voies motrices avec l’application de Cre-dépendant-DREADDs, élargissant ainsi la portée des études de régénération multimodale.

Les vecteurs viraux sont des outils biologiques importants avec un large éventail d’applications, y compris l’introduction de matériel génétique pour remplacer les gènes cibles, réguler à la hausse les protéines de croissance et tracer le paysage anatomique du SNC ^7,8,9. De nombreux détails anatomiques des voies motrices de la colonne vertébrale ont été étudiés à l’aide de traceurs classiques, c’est-à-dire l’amine de dextrane biotinylée. Bien que les traceurs traditionnels aient joué un rôle déterminant dans la découverte de la neuroanatomie, ils ne sont pas sans inconvénients: ils marquent indistinctement les voies même s’ils sont correctement injectés, et des études ont montré qu’ils sont absorbés par des axones endommagés^10,11,12. Par conséquent, cela pourrait conduire à des interprétations incorrectes dans les études de régénération où les axones sectionnés pourraient être confondus avec des fibres régénérantes.

La méthode suivante utilise le système de vecteurs biviraux récemment popularisé dans les études de modulation, avec deux vecteurs viraux différents dans deux zones distinctes du même neurone^13,14. Le premier est un vecteur qui infecte localement les corps cellulaires des neurones de projection. L’autre est un vecteur rétrograde transporté depuis les terminaisons axonales des neurones de projection (Figure 1). Le vecteur rétrograde porte la Cre recombinase, et le vecteur local incorpore la séquence à double flox « Cre-On » dans laquelle une protéine fluorescente (mCherry) est codée. Le transgène natif exprimant à la fois hM3Dq et mCherry est inversé par rapport au promoteur et est flanqué de deux sites LoxP (Figure 2). Ainsi, mCherry n’est exprimé que dans les neurones de projection doublement transduits où la Cre recombinase induit un événement de recombinaison entre les sites LoxP, inversant l’orientation du transgène dans le cadre de lecture approprié et permettant l’expression à la fois du DREADD et de la protéine fluorescente. Une fois que le transgène viral est dans la bonne orientation, et le cas échéant, les DREADDs peuvent induire transitoirement une neuromodulation par le biais d’un ligand injecté séparément, c’est-à-dire la clozapine-N-oxyde. Le protocole a été conçu pour authentifier la recherche sur la neuromodulation inductible chez les nouveau-nés, dans laquelle des DREADDS sont injectés pour moduler les CST de manière sélective. Le système biviral agit comme une police d’assurance, garantissant que chaque cellule DREADD-positive est traçable sous fluorescence avec une haute fidélité pour valider les injections.

Cette méthode aide également à combler les lacunes dans la recherche néonatale. La lésion médullaire pédiatrique présente ses défis, et la recherche analysant la régénération, la germination ou la plasticité devrait mettre l’accent sur les différences entre les nouveau-nés et les adultes 3,15,16,17. En optimisant l’intervention chirurgicale et en réalisant des études anatomiques préalables avec coloration Nissl, les coordonnées des injections crâniennes et vertébrales ont été validées. L’objectif était de fournir une méthode d’injections doubles chez un rat nouveau-né avec une fidélité et une capacité de survie accrues.

Pour le modèle actuel, le vecteur antérograde a été injecté dans les corps cellulaires du cortex somatomoteur en utilisant le bregma comme référence^18,19. En ce qui concerne les injections vertébrales, le vecteur rétrograde a été injecté dans les lames V-VII, où résident les terminaux axonaux CST^20,21. De nombreuses questions fondamentales sous-tendent la façon dont certains modèles de lésions affectent différemment les jeunes animaux et comment le rétablissement ultérieur diverge d’un animal plus âgé. Cette étude démontre un moyen robuste d’étudier les lésions cervicales et la récupérabilité de la fonction des membres antérieurs chez les rongeurs néonatals. En revanche, la majorité des études antérieures ont porté sur la locomotion de récupération à la suite de blessures lombaires ou thoraciques 5,22,23,24. En associant le vecteur double viral à la nouvelle technique d’injection décrite ici, ce protocole aide à atténuer certains problèmes (c.-à-d. la capacité de survie) qui peuvent nuire aux enquêtes néonatales sur les rongeurs. Cette méthode est robuste, pratique et polyvalente : de légères variations dans la technique permettront de cibler différentes voies, c’est-à-dire la CST ventrale, la CST dorsale et les voies dorsales ascendantes.

Pour ce système, un virus à action locale (par exemple, AAV2) est injecté dans la région des corps cellulaires neuronaux d’intérêt. Un deuxième virus transporté rétrograde qui contrôle l’expression du virus local est injecté aux terminaisons axonales pour cette population neuronale. Ainsi, par définition, seuls les neurones corticospinaux sont étiquetés. Le virus rétroAAV-Cre a été choisi avec un promoteur de CMV constituant actif, car le plasmide navette est utilisé pour générer plusieurs sérotypes AAV pour l’expression Cre-dépendante dans plusieurs types cellulaires. Pour les injections corticales, AAV2 a été choisi avec le transgène entraîné par le promoteur de la synapsine-1 pour limiter toute expression aux neurones. Parce que le système 2-viral repose davantage sur l’origine et la terminaison de la population neuronale d’intérêt, plusieurs promoteurs différents pourraient être utilisés, s’ils peuvent conduire l’expression des gènes d’intérêt au sein de la population neuronale d’intérêt. Par exemple, le promoteur neuronal excitateur, CamKII, pourrait être substitué à la synapsine-1. En plus de l’utilisation de ces sérotypes AAV, le transport rétrograde dans les motoneurones corticospinaux immatures et, dans une bien moindre mesure, adultes peut également être réalisé à l’aide du lentivirus transportable hautement rétrograde (HiRet)²⁵. Les lentivirus HiRet utilisent une glycoprotéine chimérique rage/VSV pour cibler l’absorption au niveau de la synapse pour le transport rétrograde. Combiné à un promoteur Tet-On, ce système 2-viral supporte l’expression inductible de manière rétrograde^{dépendante 26,27}.

Les virus rétrogrades insèrent des vecteurs dans l’espace synaptique d’un neurone cible, ce qui lui permet d’être absorbé par l’axone de cette cellule et transporté vers le corps cellulaire. Alors que les vecteurs lentiviraux ont déjà connu un énorme succès, fournissant une expression à long terme dans les études de thérapie génique, cette méthode s’est tournée vers les vecteurs viraux adéno-associés pour quelques raisons simples^26,28: AAV est plus économique, tout aussi efficace et présente moins de fardeau logistique, étant donné qu’il a une désignation de niveau de biosécurité inférieure 29,30,31,32 . Alors que AAV2, le sérotype le plus utilisé, démontre une transfection robuste des axones CST, les futurs chercheurs pourraient noter que AAV1 offre une certaine polyvalence car il marque de manière transynaptique, mettant ainsi en avant plusieurs itérations possibles dans de futures études³³. L’adaptation finale consiste à coder le virus rétrograde avec la Cre-recombinase afin que plusieurs vecteurs antérogrades puissent être introduits simultanément, réduisant ainsi les déchets viraux internes inutiles et maximisant la probabilité que les DREADDs s’expriment dans la bonne orientation.

En fin de compte, ce protocole démontre l’injection simultanée dans le cortex et la colonne cervicale, ciblant spécifiquement les corps cellulaires et les terminaisons axonales du tractus corticospinal, respectivement. La transfection haute fidélité est observée dans le cortex cérébral et la moelle épinière. Bien que le protocole décrit ait été perfectionné pour les rats Sprague Dawley âgés de 5 jours, il convient aux jours postnataux 4 à 10 avec des ajustements mineurs à l’anesthésie et aux coordonnées stéréotaxiques.

Protocol

Toutes les procédures chirurgicales et de soins aux animaux suivantes ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Temple. Le protocole décrit est une chirurgie de survie, et les animaux ont finalement été euthanasiés par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à la fin de leurs points temporels. 1. Préparation préopératoire Préparer au moins deux aiguilles en verre tiré pour l’injection virale …

Representative Results

L’injection et le transport réussis du vecteur viral devraient entraîner la transduction des neurones unilatéraux dans la moelle épinière et le cortex moteur. La figure 4 montre le marquage des neurones CST de couche V dans le cortex moteur d’une section coronale cérébrale exprimant Cre-dépendant-DREADDs-mCherry co-injecté avec une injection controlatérale de rCre dans la colonne vertébrale. Les sections ont été colorées avec l’anticorps dsRed. <p class="jove_content"…

Discussion

La modulation génétique inductible de l’activité cérébrale avec des modificateurs chimiogénétiques injectables est un outil puissant pour étudier les divers mécanismes qui sous-tendent la récupération des lésions médullaires. La précision du ciblage des récepteurs couplés aux protéines G inductibles (DREADD) est encore accrue si l’on considère que le tracé de fluorescence valide la précision anatomique en histologie. Cet article traite d’une méthode fiable pour explorer si l’inhibition ou la …

Materials

#11 scalpel blades	Roboz	RS-9801-11	For use with the scalpel.
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic SC injection and fluid bolus
4.0 silk suture	Ethicon	771-683G	For skin closure
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation
Ketamine (Ketaset)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	To hold the neonatal sterotaxic holder in place
Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor		51615	For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361)	Bryan Roth’s lab through Addgene		DREADD plasmid
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.
Liquid bandage	NewSkin	985838	To apply along sutures following surgery and encourage wound healing
Wire Cage Lamp	ZooMed	LF10EC	To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally