मानव ऑस्टियोआर्थ्रिटिक घुटने संयुक्त से ऊतक संग्रह और आरएनए निष्कर्षण
Summary
कुल घुटने के बाद रोगियों से प्राप्त प्राथमिक ऊतक अधिकतम नैदानिक अनुवाद के साथ ऑस्टियोआर्थराइटिस अनुसंधान के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल मानव ऑस्टियोआर्थराइटिस में मशीनी जांच का समर्थन करने के लिए सात अद्वितीय घुटने के ऊतकों से आरएनए की पहचान, प्रक्रिया और अलग-थलग करने का वर्णन करता है।
Abstract
ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) एक पुरानी और अपक्षयी संयुक्त रोग है जो अक्सर घुटने को प्रभावित करता है। चूंकि वर्तमान में कोई इलाज नहीं है, इसलिए कुल घुटने की आर्थ्रोप्लास्टी (TKA) एक आम शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप है। टीकेए से प्राप्त प्राथमिक मानव ओए ऊतकों का उपयोग करने वाले प्रयोग रोग तंत्र पूर्व वीवोकी जांच करने की क्षमता प्रदान करते हैं । जबकि OA पहले मुख्य रूप से उपास्थि प्रभाव सोचा था, यह अब संयुक्त में कई ऊतकों को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है । यह प्रोटोकॉल घुटने के जोड़ में रोग तंत्र जांच का समर्थन करने के लिए सात अद्वितीय ऊतकों में से प्रत्येक से रोगी चयन, नमूना प्रसंस्करण, ऊतक समरूपता, आरएनए निष्कर्षण, और गुणवत्ता नियंत्रण (आरएनए शुद्धता, अखंडता और उपज के आधार पर) का वर्णन करता है। सूचित सहमति के साथ, ओए के लिए TKA से गुजर रहे रोगियों से नमूने प्राप्त किए गए थे । ऊतकों को विच्छेदन, धोया गया और सर्जरी के 4 घंटे के भीतर आरएनए या हिस्ट्रोलॉजी के लिए फॉर्मेलिन निर्धारण के लिए फ्लैश फ्रीजिंग द्वारा संग्रहीत किया गया था। एकत्र किए गए ऊतकों में आर्टिकुलर कार्टिलेज, सबकॉन्ड्रल बोन, मेनिस्कस, इन्फ्रापेटलर फैट पैड, पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु, सिनोवियम, और वास्तुसंस परोक्ष मांसपेशी शामिल थे। आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए परीक्षण किया गया। सबसे महत्वपूर्ण संशोधन में कम कोशिका, उच्च मैट्रिक्स, कठोर ऊतकों (उपास्थि, हड्डी और मेनिस्कस के रूप में माना जाता है) बनाम अपेक्षाकृत उच्च कोशिका, कम मैट्रिक्स, नरम ऊतकों (वसा पैड, स्नायु, सिनोवियम, और मांसपेशियों के रूप में माना जाता है) के लिए उपयोग किए जाने वाले विघटन की विधि शामिल थी। यह पाया गया कि फेफड़े का सरलीकरण कठोर ऊतकों के लिए उपयुक्त था, और समरूपता नरम ऊतकों के लिए उपयुक्त था। कई ऊतकों में लगातार अन्य विषयों की तुलना में उच्च आरएनए अखंडता संख्या (आरआईआर) मूल्यों को प्राप्त करने के लिए कुछ विषयों के लिए एक प्रवृत्ति देखी गई, जिससे यह सुझाव दिया गया कि रोग गंभीरता जैसे अंतर्निहित कारक आरएनए गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। प्राथमिक मानव ओए ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को अलग करने की क्षमता अनुक्रमण सहित परिष्कृत जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल प्रदान करती है, जो नैदानिक अंतर्दृष्टि का कारण बन सकती है जो रोगियों के लिए अधिक आसानी से अनुवादित होती है।
Introduction
घुटने मानव शरीर में सबसे बड़ा सिनोवियल संयुक्त है, जिसमें टिबिया और फीमर के बीच टिबिओफेमोरल संयुक्त और पटेला औरफीमर 1के बीच पटेलोफेमोरल संयुक्त शामिल है। घुटने में हड्डियों को आर्टिकुलर उपास्थि के साथ रेखांकित किया जाता है और विभिन्न संयोजी ऊतकों द्वारा समर्थित किया जाता है, जिसमें मेनिसी, वसा, स्नायुबंधन और मांसपेशी शामिल हैं, और एक सिनोवियल झिल्ली पूरे संयुक्त को एक सिनोवियल तरल पदार्थ से भरे गुहा1,2,3 (चित्रा 1)बनाने के लिए समाहित करती है। एक स्वस्थ घुटने मोबाइल काज संयुक्त के रूप में कार्य करता है जो ललाट विमान में घर्षण रहित गति की अनुमति देता है1,3. रोग की स्थिति में, आंदोलन प्रतिबंधित और दर्दनाक हो सकता है। सबसे आम अपक्षयी घुटने संयुक्त रोग ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए)4है। जोखिम कारकों की एक किस्म के लिए बड़ी उम्र, मोटापा, महिला सेक्स, संयुक्त आघात, और आनुवंशिकी, दूसरों के बीच5,6 सहित OA विकास के लिए संवेदनशील करने के लिए जानाजाताहै । वर्तमान में संयुक्त राज्य अमेरिका में रोगसूचक घुटने ओए के साथ अनुमानित 14 मिलियन लोग हैं, बढ़ती जनसंख्या आयु और मोटापे की दर7,8के कारण बढ़ती व्यापकता के साथ। शुरू में उपास्थि की बीमारी मानी जाती है, ओए को अब पूरे संयुक्त 9 की बीमारी के रूप में समझाजाताहै । ओए में आमतौर पर देखे जाने वाले रोग परिवर्तनों में आर्टिकुलर कार्टिलेज कटाव, ऑस्टियोफाइट गठन, सबकॉन्ड्रल बोन मोटा होना, और सिनोवियम9,10की सूजन शामिल है। चूंकि ओए के लिए कोई ज्ञात इलाज नहीं है, इसलिए उपचार मुख्य रूप से लक्षण (जैसे, दर्द) प्रबंधन11,12पर ध्यान केंद्रित करते हैं, और एक बार ओए ने अंतिम चरण में प्रगति की है, संयुक्त प्रतिस्थापन सर्जरी अक्सर13संकेत दिया जाता है।
संयुक्त प्रतिस्थापन सर्जरी या तो आंशिक या कुल घुटने प्रतिस्थापन हो सकती है, जिसमें कुल घुटने की अरथ्रोप्लास्टी (TKA) शामिल है जिसमें पूरे टिबिओफेमोरल अभिव्यक्ति और पटेलोफेमोरल संयुक्त को बदलना शामिल है। 2020 तक, संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल 14 में लगभग1मिलियन टीकेए किए जाते हैं। TKA के दौरान, एक आर्थोपेडिक सर्जन टिबियल पठार के ऊपरी हिस्से और निचले फेमोरल कॉन्डल्स(चित्रा 2 ए,2B)को कृत्रिम प्रत्यारोपण के साथ फिट करने के लिए पुनः प्राप्त करता है। कभी-कभी रोगियों द्वारा गलत व्याख्या की जाती है, एक TKA में, प्रत्येक हड्डी के अंत से केवल 8-10 मिमी को पुनः प्राप्त किया जाता है, जो बाद में धातु के साथ छाया हुआ या फिर से उभर जाता है। एक इंटरपोस्ड पॉलीथीन लाइनर दो धातु प्रत्यारोपण के बीच असर सतह (यानी, पैडिंग) बनाता है। इसके अलावा, संयुक्त के कई नरम ऊतक घटकों को उचित संयुक्त संतुलन प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से या आंशिक रूप से उत्पादित किया जाता है। इन ऊतकों में औसत दर्जे का और पार्श्व menisci(चित्रा 2C),इन्फ्रापेटलर फैट पैड(चित्रा 2डी),पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु (एसीएल; चित्रा 2E),सिनोवियम(चित्रा 2F),और वास्तु परोक्ष मांसपेशी (VMO; चित्रा 2G) 15. हालांकि TKAs आम तौर पर OA उपचार के लिए सफल रहे हैं, रोगियों के लगभग 20% दर्द के बाद सर्जरी16की पुनरावृत्ति की रिपोर्ट । प्रक्रिया की उच्च लागत और सापेक्ष आक्रामकता के साथ, ये सीमाएं ओए की प्रगति को कम करने के लिए वैकल्पिक उपचारों की पहचान करने के लिए आगे के अनुसंधान की आवश्यकता को इंगित करती हैं।
ओए में रोग तंत्र का पता लगाने के लिए जो चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए नए रास्ते पेश कर सकते हैं, कोशिकाओं, ऊतक प्रत्यारोपण और पशु मॉडल सहित प्रयोगात्मक प्रणालियों का उपयोग किया जा सकता है। कोशिकाओं को आम तौर पर मोनोलेयर में सुसंस्कृत किया जाता है और प्राथमिक मानव या पशु ऊतकों (उदाहरण के लिए, उपास्थि से अलग chondrocytes) या अमर कोशिकाओं (जैसे, ATDC517 और CHON-00118)से प्राप्त कर रहे हैं । जबकि कोशिकाओं को एक नियंत्रित संस्कृति वातावरण में प्रयोगात्मक चर हेरफेर के लिए उपयोगी हो सकता है, वे प्राकृतिक संयुक्त जो सेल फेनोटाइप19प्रभाव के लिए जाना जाता है की स्थितियों पर कब्जा नहीं है । ओए में अंतर्निहित रासायनिक, यांत्रिक और सेल-टू-सेल संचार के जटिल झरने को बेहतर ढंग से पुनः स्थापित करने के लिए, एक विकल्प प्राथमिक मानव या पशु ऊतक नमूनों में पाया जाता है, चाहे ऊतक संरचना और सेल माइक्रोएनवायरमेंट20को संरक्षित करने के लिए, नए या सुसंस्कृत पूर्व वीवो को एक्सप्लांट के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। वीवो मेंसंयुक्त का अध्ययन करने के लिए, छोटे (जैसे, माउस21)और बड़े (उदाहरण के लिए, ओए के लिए घोड़ा22)पशु मॉडल (उदाहरण के लिए, सर्जिकल प्रेरण, आनुवंशिक परिवर्तन, या उम्र बढ़ने के माध्यम से) भी उपयोगी होते हैं। हालांकि, इन मॉडलों से मानव रोग में अनुवाद शारीरिक, शारीरिक और मेटाबोलिक मतभेदों द्वारा सीमित किया जा सकता है, दूसरों के बीच23। प्रयोगात्मक प्रणालियों के फायदे और नुकसान को ध्यान में रखते हुए, प्रजातियों के विशिष्ट होने और प्राथमिक मानव ओए ऊतकों द्वारा पेश किए गए बाहुलीय आला को बनाए रखने की प्रमुख ताकत अनुसंधान निष्कर्षों की अनुवादात्मक क्षमता को अधिकतम करती है।
प्राथमिक मानव ओए ऊतकों को TKA के बाद आसानी से प्राप्त किया जा सकता है, जिससे टीकेएएस की उच्च आवृत्ति अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन बन जाती है। संभावित प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों में जीन अभिव्यक्ति और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण हैं। इन अनुसंधान दृष्टिकोण और दूसरों के लिए प्राथमिक मानव OA ऊतकों की क्षमता का एहसास करने के लिए, उल्लिखित निम्नलिखित महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । सबसे पहले, रोगी नमूनों का उपयोग नैतिक विनियमन के अधीन है, और प्रोटोकॉल संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) मंजूरी24को पूरा करना चाहिए । दूसरा, मानव प्राथमिक रोगग्रस्त ऊतकों की अंतर्निहित विषमता और उम्र और लिंग जैसे चरों के प्रभाव, दूसरों के बीच, सावधान रोगी चयन (यानी, पात्रता मानदंडों का आवेदन) और डेटा व्याख्या की आवश्यकता पैदा करते हैं। तीसरा, संयुक्त में विभिन्न ऊतकों के अद्वितीय जैविक गुण (उदाहरण के लिए, उपास्थि और मेनिस्कस25की कम सेलुलरिटी) प्रयोगों के दौरान चुनौतियां पेश कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, उच्च गुणवत्ता और आरएनए की मात्रा को अलग करना)। यह रिपोर्ट इन बातों को संबोधित करती है और रोगी चयन, नमूना प्रसंस्करण, ऊतक समरूपता, आरएनए निष्कर्षण और गुणवत्ता नियंत्रण (यानी आरएनए शुद्धता और अखंडता का आकलन) के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है; चित्रा 3) अनुसंधान समुदाय में प्राथमिक मानव OA ऊतकों के उपयोग को प्रोत्साहित करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल आरएनए निष्कर्षण(तालिका 1)और हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग(चित्र 4)के लिए सात प्राथमिक मानव ओए ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए सफल साबित हुआ है। रोगी के नमूनों को इकट्ठा करने …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अध्ययन प्रतिभागियों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इस शोध को संभव बनाया और ऑस्टियोआर्थराइटिस क्षेत्र में नए वैज्ञानिकों को इस रिपोर्ट को समर्पित किया ।
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
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