איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי
Summary
רקמות ראשוניות המתקבלות מחולים בעקבות ארתרופלסטיקה כוללת בברך מספקות מודל ניסיוני למחקר דלקת מפרקים ניוונית עם תרגום קליני מקסימלי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לזהות, לעבד ולבודד RNA משבע רקמות ברכיים ייחודיות כדי לתמוך בחקירה מכנית בדלקת מפרקים ניוונית אנושית.
Abstract
דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלת מפרקים כרונית וניוונית המשפיעה לרוב על הברך. מכיוון שאין כרגע תרופה, ארתרופלסטיקה מוחלטת בברך (TKA) היא התערבות כירורגית נפוצה. ניסויים באמצעות רקמות OA אנושיות ראשוניות המתקבלות מ- TKA מספקים את היכולת לחקור מנגנוני מחלה ex vivo. בעוד OA נחשב בעבר להשפיע בעיקר על הסחוס, זה ידוע עכשיו להשפיע על רקמות מרובות במפרק. פרוטוקול זה מתאר בחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות (המבוססת על טוהר RNA, שלמות ותשואה) מכל אחת משבע רקמות ייחודיות לתמיכה בחקירת מנגנון המחלה במפרק הברך. בהסכמה מדעת, התקבלו דגימות מחולים שעברו TKA עבור OA. רקמות נותחו, נשטפו ואוחסנו תוך 4 שעות מהניתוח על ידי הקפאת הבזק עבור RNA או קיבעון פורמלין להצטולוגיה. רקמות שנאספו כללו סחוס מפרקי, עצם תת-כונדרלית, מניסקוס, כרית שומן אינפר-פטלר, רצועה צולבת, סינוביום ושריר האלכסוני vastus medialis. פרוטוקולי מיצוי RNA נבדקו עבור כל סוג רקמה. השינוי המשמעותי ביותר כלל את שיטת ההתפוררות המשמשת לרקמות קשות בעלות תאים נמוכים, גבוהים, (הנחשבים לסחוס, עצם ומניסקוס) לעומת תאים גבוהים יחסית, מטריצה נמוכה, רקמות רכות (נחשבות כרית שומן, רצועה, סינוביום ושרירים). נמצא כי ריכוך היה מתאים לרקמות קשות, והומוגניזציה מתאימה לרקמות רכות. נצפתה נטייה של נבדקים מסוימים להניב ערכי שלמות RNA גבוהים יותר (RIN) מאשר נבדקים אחרים באופן עקבי על פני רקמות מרובות, דבר המצביע על כך שגורמים הבסיסיים כגון חומרת המחלה עשויים להשפיע על איכות ה- RNA. היכולת לבודד RNA באיכות גבוהה מרקמות OA אנושיות ראשוניות מספקת מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לניסויי ביטוי גנים מתוחכמים, כולל רצף, שיכול להוביל לתובנות קליניות שתורגמו בקלות רבה יותר לחולים.
Introduction
הברך היא המפרק הסינוביאלי הגדול ביותר בגוף האדם, הכולל את מפרק הטיביו-דימורל בין השוקה לירך ומפרק הפטלו-מורל בין פיקת הברך לירך1. העצמות בברך מרופדים בסחוס מפרקי ונתמכות על ידי רקמות חיבור שונות, כולל מנישי, שומן, רצועות ושרירים, וממברנה סינוביאלית מתמצתת את כל המפרק כדי ליצור חלל מלא נוזלים סינוביאלי1,2,3 ( איור1). ברך בריאה מתפקדת כמפרק ציר נייד המאפשר תנועה ללא חיכוך במישור הקדמי1,3. בתנאים פתולוגיים, התנועה יכולה להיות מוגבלת וכואבת. מחלת מפרק הברך הניוונית הנפוצה ביותר היא דלקת מפרקים ניוונית (OA)4. מגוון גורמי סיכון ידועים נטייה להתפתחות OA, כולל גיל מבוגר יותר, השמנת יתר, מין נשי, טראומה משותפת, וגנטיקה, בין היתר5,6. ישנם כיום כ -14 מיליון אנשים בארה”ב עם OA ברך סימפטומטי, עם השכיחות גדלה עקב עלייה בגיל האוכלוסייה ושיעורי השמנת יתר7,8. בתחילה נחשב למחלה של הסחוס, OA הוא עכשיו הבין כמחלה של המפרק כולו9. שינויים פתולוגיים שנצפו בדרך כלל ב- OA כוללים שחיקת סחוס מפרקי, היווצרות אוסטאופית, עיבוי עצם תת-ביתית ודלקת של הסינוביום9,10. מאז אין תרופה ידועה עבור OA, טיפולים מתמקדים בעיקר סימפטום (למשל, כאב) ניהול11,12, ולאחר OA התקדם לשלב הסופי, ניתוח החלפת מפרקים הוא ציין לעתים קרובות13.
ניתוחי החלפת מפרקים יכולים להיות חלקיים או כוללים של החלפת ברך, עם ארתרופלסטיקה כוללת בברך (TKA) כולל החלפת כל הניסוח הטיביו-מורלי והמפרק הפטלו-מורלי. נכון לשנת 2020, כמיליון TKAs מבוצעים בארה”ב מדי שנה14. במהלך TKA, מנתח אורטופדי חוצה את החלק העליון של רמת הטיבי ואת חמצת הירך התחתונה (איור 2A, 2B) כדי להיות מצויד בשתלים תותבים. לפעמים לא לפרש על ידי חולים, ב TKA, רק 8-10 מ”מ נפלט מקצה כל עצם, אשר לאחר מכן כתרים או צף מחדש, עם מתכת. אניה פוליאתילנית משולבת יוצרת את משטח הנושא (כלומר, ריפוד) בין שני שתלי המתכת. בנוסף, מספר רכיבי רקמות רכות של המפרק הם excised באופן מלא או חלקי כדי להשיג איזון משותף נכון. בין הרקמות הללו ניתן למנות המנישי המהודל והקטנוני (איור 2C), כרית שומן אינפרא-פטלרית (איור 2D), רצועה צולבת חיצונית (ACL; איור 2E, סינוביום (איור 2F) ושריר האלמוני של vastus medialis (VMO; איור 2G) 15.למרות TKAs הם בדרך כלל מוצלחים לטיפול OA, סביב 20% מהחולים מדווחים על reoccurrence של כאב לאחר הניתוח16. יחד עם העלות הגבוהה והפולשניות היחסית של ההליך, מגבלות אלה מצביעות על הצורך במחקר נוסף כדי לזהות טיפולים חלופיים כדי למתן את התקדמות OA.
כדי לחקור מנגנוני מחלה ב- OA שעשויים להציג אפיקים חדשים להתערבות טיפולית, ניתן להשתמש במערכות ניסיוניות, כולל תאים, מגרשי רקמות ומודלים של בעלי חיים. תאים הם בדרך כלל מתורבתים monolayer נגזרים רקמות האדם או בעלי החיים העיקריים (למשל, chondrocytes מבודד סחוס) או תאים מונצחים (למשל, ATDC517 ו- CHON-00118). בעוד תאים יכולים להיות שימושיים למניפולציה משתנים ניסיוניים בסביבת תרבות מבוקרת, הם אינם ללכוד את התנאים של המפרק הטבעי אשר ידועים להשפיע פנוטיפים התא19. כדי לשחזר טוב יותר את המפל המורכב של תקשורת כימית, מכנית ותא לתא שבבסיס OA, חלופה נמצאת בדגימות ראשוניות של רקמת אדם או בעלי חיים, בין אם נעשה שימוש ב- ex vivo טרי או מתורבת כאקספלנטים, כדי לשמר את מבנה הרקמות ואת microenvironment התא20. על מנת ללמוד את המפרק ב vivo, קטן (למשל, עכבר21)וגדול (למשל, סוס22) מודלים בעלי חיים עבור OA (למשל, באמצעות אינדוקציה כירורגית, שינוי גנטי, או הזדקנות) הם גם שימושיים. עם זאת, תרגום מודלים אלה למחלות אנושיות יכול להיות מוגבל על ידי הבדלים אנטומיים, פיזיולוגיים ומטבוליים, בין היתר23. בהתחשב ביתרונות ובחסרונות של מערכות ניסיוניות, נקודות החוזק העיקריות של היותן ספציפיות למינים ושמירה על הנישה החוץ-תאית המוצעת על ידי רקמות OA האנושיות העיקריות ממקסמות את הפוטנציאל התרגומי של ממצאי המחקר.
רקמות OA אנושיות ראשוניות ניתן להשיג בקלות בעקבות TKA, מה שהופך את התדירות הגבוהה של TKAs משאב בעל ערך למחקר. בין היישומים הניסיוניים הפוטנציאליים הם ביטוי גנים וניתוחים היסתולוגיים. כדי לממש את הפוטנציאל של רקמות OA אנושיות ראשוניות עבור גישות מחקר אלה ואחרים, המתוארים הם השיקולים העיקריים הבאים. ראשית, השימוש בדגימות מטופלים כפוף לרגולציה אתית, והפרוטוקולים חייבים לעמוד באישורי ועדת הביקורת המוסדית (IRB)24. שנית, ההטרוגניות הטבועה של רקמות החולים העיקריות האנושיות והשפעת משתנים כגון גיל ומין, בין היתר, יוצרות את הצורך בבחירת מטופלים זהירה (כלומר, יישום קריטריוני זכאות) ופרשנות נתונים. שלישית, התכונות הביולוגיות הייחודיות של רקמות שונות במפרק (למשל, תאיות נמוכה של סחוס ומניסקוס25) יכולות להציג אתגרים במהלך ניסויים (למשל, בידוד איכות גבוהה וכמות של RNA). דוח זה מתייחס לשיקולים אלה ומציג פרוטוקול לבחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות (כלומר, הערכת טוהר ושלמות ה-RNA; איור 3) כדי לעודד את השימוש ברקמות OA האנושיות העיקריות בקהילת המחקר.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שהוצג הוכח כמוצלח לאיסוף שבע רקמות OA אנושיות עיקריות להפקת RNA (טבלה 1) ועיבוד היסתולוגי (איור 4). לפני איסוף דגימות המטופל, יש צורך להקים פרוטוקול שאושר על ידי IRB, באופן אידיאלי בשיתוף פעולה עם מנתח או צוות כירורגי. החלת פרוטוקול מתוקנן עבור אוסף דגימות (לדו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למשתתפי המחקר שאפשרו את המחקר ומקדישים את הדו”ח הזה למדענים חדשים בתחום דלקת מפרקים ניוונית.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
Riferimenti
- Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. . Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).
- Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
- Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. . Anatomy, Hinge Joints. , (2020).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
- Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
- O’Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
- Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
- Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
- Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
- Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
- Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
- Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
- Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , (2020).
- Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
- Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
- Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
- Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
- Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
- Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
- Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
- Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
- Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
- Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
- Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
- Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
- Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
- Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
- Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
- Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
- Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).
