Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Summary

Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 de C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans ha sido un importante sistema modelo para la investigación biológica desde que se introdujo en 1963. Sin embargo, C. elegans no se ha utilizado completamente en el estudio bioquímico de reacciones biológicas utilizando sus extractos nucleares, como la transcripción in vitro y la replicación del ADN. Un obstáculo significativo para el uso de C. elegans en estudios bioquímicos es interrumpir la gruesa cutícula externa del nematodo sin sacrificar la actividad del extracto nuclear. Si bien se utilizan varios métodos para romper la cutícula, como la homogeneización o la sonicación de Dounce, a menudo conducen a la inestabilidad de las proteínas. No existen protocolos establecidos para aislar proteínas nucleares activas de larvas o adultos de C. elegans para reacciones in vitro . Aquí, el protocolo describe en detalle la homogeneización de la etapa larvaria 4 C. elegans utilizando un homogeneizador Balch. El homogeneizador Balch utiliza presión para forzar lentamente a los animales a través de un estrecho espacio que rompe la cutícula en el proceso. El diseño uniforme y el mecanizado preciso del homogeneizador Balch permiten una molienda constante de animales entre experimentos. El fraccionamiento del homogeneizado obtenido del homogeneizador Balch produce un extracto nuclear funcionalmente activo que se puede utilizar en un método in vitro para evaluar la actividad de transcripción de C. elegans.

Introduction

El pequeño nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans es un organismo modelo simple pero poderoso para abordar una amplia gama de preguntas biológicas. Desde su introducción en 1963, los nematodos han sido invaluables para responder preguntas en neurobiología, metabolismo, envejecimiento, desarrollo, inmunidad y ^genética1. Algunas de las muchas características del animal que lo convierten en un organismo modelo ideal incluyen el corto tiempo de generación, la efectividad de la interferencia de ARN, el cuerpo transparente y los mapas completos tanto de su linaje celular como de su sistema nervioso.

Si bien las contribuciones del nematodo a la ciencia son vastas, se han subutilizado para dilucidar el sistema de transcripción eucariota, y la mayor parte de nuestra comprensión sobre estos mecanismos proviene de estudios que utilizan extracto nuclear de levadura, mosca de la fruta y cultivo de células de ^mamíferos2. El mayor obstáculo que disuade a los investigadores de extraer extracto nuclear funcional es la dura cutícula externa del nematodo. Este exoesqueleto comprende colágenos, cuticlinas, glicoproteínas y lípidos reticulados, lo que hace que C. elegans desde la etapa larvaria hasta la edad adulta sea resistente a la extracción de proteínas a través de fuerzas químicas o mecánicas3. Una vez se desarrolló un sistema de transcripción in vitro que utiliza extracto nuclear de C. elegans, pero no se adoptó ampliamente debido al alcance limitado del sistema, y el uso del homogeneizador Dounce para preparar el extracto podría conducir a la inestabilidad de la ^proteína4,5.

A diferencia del protocolo anterior para el aislamiento de extractos nucleares que utilizaba un homogeneizador Dounce para romper C. elegans, este protocolo utiliza un homogeneizador Balch. El homogeneizador Balch consta de dos componentes principales: una bola de carburo de tungsteno y un bloque de acero inoxidable con un canal perforado de un extremo a otro. El homogeneizador Balch se carga con la bola de carburo de tungsteno y se tapa a cada lado para sellar la cámara de molienda. Las jeringas se pueden cargar en los dos puertos verticales que conducen a la cámara de molienda. A medida que el material pasa de una jeringa a la otra a través de la cámara de molienda, la presión de las jeringas fuerza el material a través de un espacio estrecho entre la bola y la pared de la cámara. Esta presión lenta y constante rompe el material hasta que alcanza un tamaño consistente que es capaz de pasar a través del espacio estrecho fácilmente. Forzar a C. elegans a través de la estrecha brecha a través de una presión constante pero suave rompe la apertura de los animales, liberando su contenido en el amortiguador circundante. Cambiar el tamaño de las bolas aprieta aún más la brecha, rompiendo las células recién liberadas y libera los núcleos en el tampón. Múltiples instancias de centrifugación separan los núcleos del resto de los desechos celulares, lo que permite la recolección de un extracto nuclear limpio. El homogeneizador Balch es preferido sobre el homogeneizador Dounce por varias razones: el sistema puede manejar una gran cantidad de animales, lo que permite extraer una gran cantidad de proteínas activas en un solo intento; el mecanizado preciso de las bolas y el bloque de acero permite un rectificado consistente entre múltiples muestras; el bloque de acero pesado actúa como un disipador de calor, extrayendo uniformemente el calor de la cámara de molienda, evitando la desnaturalización.

Después del aislamiento, la actividad transcripcional del extracto nuclear debe verificarse antes de ser utilizada en cualquier experimento bioquímico. Tradicionalmente, la actividad de transcripción se medía utilizando nucleótidos radiomarcados para rastrear y visualizar el ARN recién sintetizado. Sin embargo, el etiquetado radiactivo puede ser oneroso, ya que requiere precaución durante el uso y la ^{eliminación6}. Los avances tecnológicos permiten a los investigadores de hoy utilizar métodos mucho menos dañinos o problemáticos para medir incluso pequeñas cantidades de ARN utilizando técnicas como la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)⁷. Aquí, el protocolo describe un método para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 (L4) C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro.

Protocol

1. Preparación de los medios de comunicación Prepare placas de agar de caldo de lisogenia (LB) estériles y medios líquidos siguiendo las instrucciones del fabricante. Streak Escherichia coli (E. coli) cepa OP50 en una placa de agar LB. Incubar la racha de bacterias a 37 °C durante la noche. Guarde la placa de rayas de E. coli OP50 a 4 °C después de la incubación. La placa op50 de E. coli se puede almacenar de forma segura a 4 °C durante 2 semanas …

Representative Results

Siguiendo los pasos descritos se debe producir extracto nuclear funcional (Figura 1), la desviación en los pasos de molienda o lavado puede conducir a una actividad deficiente o bajos rendimientos. Si se obtiene extracto nuclear funcional de C. elegans , transcribirá la región aguas abajo del promotor cmv en la plantilla de ADN cuando se agregue al ensayo in vitro descrito anteriormente. La transcripción de ARN resultante se puede purif…

Discussion

C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar el sistema de transcripción eucariota debido a su bajo costo de mantenimiento y la facilidad de manipulación genética. Aquí se describe un protocolo para el aislamiento consistente del extracto nuclear funcionalmente activo de L4 C. elegans . Aunque este protocolo se centró en visualizar la actividad de transcripción, el ADNc producido post-transcripcionalmente se puede cuantificar mediante RT-qPCR para obtener una medición más precisa de…

Materials

Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010