Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Summary

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von aktivem Kernextrakt aus Larvenstadium 4 C. elegans und visualisierung der Transkriptionsaktivität in einem in vitro System.

Abstract

Caenorhabditis elegans ist seit seiner Einführung im Jahr 1963 ein wichtiges Modellsystem für die biologische Forschung. C. elegans wurde jedoch nicht vollständig in der biochemischen Untersuchung biologischer Reaktionen unter Verwendung seiner Kernextrakte wie In-vitro-Transkription und DNA-Replikation eingesetzt. Eine wesentliche Hürde für die Verwendung von C. elegans in biochemischen Studien ist die Störung der dicken äußeren Kutikula des Fadenwurms, ohne die Aktivität des Kernextrakts zu beeinträchtigen. Während mehrere Methoden verwendet werden, um die Kutikula zu brechen, wie z.B. Dounce-Homogenisierung oder Beschallung, führen sie oft zu Proteininstabilität. Es gibt keine etablierten Protokolle für die Isolierung aktiver Kernproteine aus Larven oder erwachsenen C. elegans für In-vitro-Reaktionen . Hier beschreibt das Protokoll detailliert die Homogenisierung von Larvenstadium 4 C. elegans unter Verwendung eines Balch-Homogenisators. Der Balch-Homogenisator verwendet Druck, um die Tiere langsam durch eine enge Lücke zu zwingen, die dabei die Nagelhaut bricht. Das einheitliche Design und die präzise Bearbeitung des Balch Homogenisators ermöglichen ein gleichmäßiges Schleifen der Tiere zwischen den Versuchen. Die Fraktionierung des aus dem Balch-Homogenisator erhaltenen Homogenats ergibt einen funktionell aktiven Kernextrakt, der in einer In-vitro-Methode zur Bestimmung der Transkriptionsaktivität von C. elegans verwendet werden kann.

Introduction

Der kleine, freilebende Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein einfacher, aber leistungsfähiger Modellorganismus zur Beantwortung einer Vielzahl biologischer Fragestellungen. Seit ihrer Einführung im Jahr 1963 sind die Nematoden von unschätzbarem Wert für die Beantwortung von Fragen der Neurobiologie, des Stoffwechsels, des Alterns, der Entwicklung, der Immunität und der ^Genetik1. Zu den vielen Eigenschaften des Tieres, die es zu einem idealen Modellorganismus machen, gehören die kurze Generationszeit, die Wirksamkeit der RNA-Interferenz, der transparente Körper und die vollständigen Karten seiner zellulären Abstammung und seines Nervensystems.

Während die Beiträge des Nematoden zur Wissenschaft enorm sind, wurden sie nicht ausreichend genutzt, um das eukaryotische Transkriptionssystem aufzuklären, wobei der größte Teil unseres Verständnisses über diese Mechanismen aus Studien stammt, die Kernextrakt aus Hefe, Fruchtfliege und Säugetierzellkultur ^verwenden2. Die größte Hürde, die Forscher davon abhält, funktionellen Kernextrakt zu extrahieren, ist die zähe äußere Kutikula des Nematoden. Dieses Exoskelett besteht aus vernetzten Kollagenen, Cuticlinen, Glykoproteinen und Lipiden, wodurch C. elegans vom Larvenstadium bis zum Erwachsenenalter resistent gegen die Proteinextraktion durch chemische oder mechanische Kräfte ^ist3. Ein In-vitro-Transkriptionssystem unter Verwendung von C. elegans-Kernextrakt wurde einst entwickelt, aber aufgrund des begrenzten Anwendungsbereichs des Systems nicht weit verbreitet, und die Verwendung eines Dounce-Homogenisators zur Herstellung des Extrakts könnte zu Proteininstabilität ^führen4,5.

Im Gegensatz zum vorherigen Protokoll zur Isolierung von Kernextrakten, bei dem ein Dounce-Homogenisator zum Brechen von C. elegans verwendet wurde, verwendet dieses Protokoll einen Balch-Homogenisator. Der Balch Homogenisator besteht aus zwei Hauptkomponenten: einer Hartmetallkugel und einem Edelstahlblock mit einem Kanal, der von einem Ende zum anderen durchbohrt ist. Der Balch Homogenisator wird mit der Hartmetallkugel beladen und auf beiden Seiten verschlossen, um die Mahlkammer abzudichten. Spritzen können auf die beiden vertikalen Ports geladen werden, die in die Mahlkammer führen. Wenn das Material durch die Mahlkammer von einer Spritze zur anderen geleitet wird, drückt der Druck der Spritzen das Material durch einen engen Spalt zwischen der Kugel und der Wand der Kammer. Dieser langsame und konstante Druck bricht das Material, bis es eine konstante Größe erreicht, die in der Lage ist, den engen Spalt leicht zu passieren. C . elegans durch einen konstanten, aber sanften Druck durch den engen Spalt zu zwingen, bricht die Tiere auf und gibt ihren Inhalt in den umgebenden Puffer ab. Das Umschalten der Kugelgrößen verschärft den Spalt weiter, bricht die neu freigesetzten Zellen auf und befreit die Kerne in den Puffer. Mehrere Fälle von Zentrifugation trennen die Kerne vom Rest der Zelltrümmer, was die Sammlung eines sauberen Kernextrakts ermöglicht. Der Balch-Homogenisator wird aus mehreren Gründen gegenüber dem Dounce-Homogenisator bevorzugt: Das System kann eine große Anzahl von Tieren verarbeiten, so dass es möglich ist, eine hohe Menge an aktiven Proteinen in einem einzigen Versuch zu extrahieren; die präzise Bearbeitung der Kugeln und des Stahlblocks ermöglicht ein gleichmäßiges Schleifen zwischen mehreren Proben; Der schwere Stahlblock wirkt wie ein Kühlkörper, der die Wärme gleichmäßig von der Mahlkammer ableitet und eine Denaturierung verhindert.

Nach der Isolierung muss die Transkriptionsaktivität des Kernextrakts überprüft werden, bevor sie in biochemischen Experimenten verwendet wird. Traditionell wurde die Transkriptionsaktivität mit radioaktiv markierten Nukleotiden gemessen, um die neu synthetisierte RNA zu verfolgen und zu visualisieren. Die radioaktive Markierung kann jedoch aufwändig sein, da sie während des Gebrauchs und der Entsorgung Vorsichtsmaßnahmen ^erfordert6. Technologische Fortschritte ermöglichen es Forschern heute, viel weniger schädliche oder lästige Methoden zu verwenden, um selbst kleine RNA-Größen mit Techniken wie der quantitativen Real-Time-PCR (qRT-PCR)⁷ zu messen. Hier beschreibt das Protokoll eine Methode zur Isolierung von aktivem Kernextrakt aus Larvenstadium 4 (L4) C. elegans und visualisierung der Transkriptionsaktivität in einem In-vitro-System.

Protocol

1. Medienvorbereitungen Bereiten Sie sterile Lysogenbrühe (LB) Agarplatten und flüssige Medien nach den Anweisungen des Herstellers vor. Streifen Escherichia coli (E. coli) Stamm OP50 auf einer LB-Agarplatte. Den Bakterienstreifen über Nacht bei 37 °C inkubieren. Lagern Sie die E. coli OP50 Streifenplatte nach der Inkubation bei 4 °C. Die E. coli OP50 Platte kann sicher bei 4 °C für 2 Wochen gelagert werden, wenn sie in Parafolie eingewickelt ist, u…

Representative Results

Die Einhaltung der skizzierten Schritte sollte funktionellen Kernextrakt ergeben (Abbildung 1), Abweichungen in den Mahl- oder Waschschritten können zu schlechter Aktivität oder geringen Ausbeuten führen. Wenn funktioneller C. elegans-Kernextrakt erhalten wird, transkribiert er die Region stromabwärts des CMV-Promotors auf der DNA-Vorlage, wenn er dem zuvor beschriebenen In-vitro-Assay hinzugefügt wird. Das resultierende RNA-Transkript…

Discussion

C. elegans ist ein attraktiver Modellorganismus zur Untersuchung des eukaryotischen Transkriptionssystems wegen seiner kostengünstigen Wartung und der Einfachkeit der genetischen Manipulation. Hier wird ein Protokoll zur konsistenten Isolierung von funktionell aktivem Kernextrakt aus L4 C. elegans beschrieben. Obwohl sich dieses Protokoll auf die Visualisierung der Transkriptionsaktivität konzentrierte, kann die posttranskriptionell produzierte cDNA mit RT-qPCR quantifiziert werden, um eine genauere M…

Materials

Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010