Creazione di una piattaforma elettrofisiologica per la modellazione della SLA con astrociti e neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane specifiche a livello regionale
Summary
Descriviamo un metodo per differenziare astrociti e neuroni di derivazione pluripotente indotta dal midollo spinale e la loro co-coltura per la registrazione elettrofisiologica.
Abstract
Gli astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) e i neuroni (hiPSC-N) forniscono un potente strumento per modellare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in vitro. Le registrazioni multi-electrode array (MEA) sono un mezzo per registrare i potenziali di campo elettrico da grandi popolazioni di neuroni e analizzare l’attività della rete nel tempo. È stato precedentemente dimostrato che la presenza di hiPSC-A che sono differenziati utilizzando tecniche per promuovere un fenotipo astrocitario del midollo spinale ha migliorato la maturazione e l’attività elettrofisiologica dei motoneuroni (MN) del midollo spinale specifici a livello regionale rispetto a quelli coltivati senza hiPSC-A o in presenza di astrociti roditori. Qui è descritto un metodo per co-coltivare il midollo spinale hiPSC-A con hiPSC-MN e registrare l’attività elettrofisiologica utilizzando registrazioni MEA. Mentre i protocolli di differenziazione qui descritti sono particolari per astrociti e neuroni che sono specifici a livello regionale per il midollo spinale, la piattaforma di co-coltura può essere applicata ad astrociti e neuroni differenziati con tecniche specifiche per altri destini, tra cui hiPSC-A corticale e hiPSC-N. Questi protocolli mirano a fornire un saggio elettrofisiologico per informare sulle interazioni glia-neurone e fornire una piattaforma per testare farmaci con potenziale terapeutico nella SLA.
Introduction
Gli astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) e i neuroni (hiPSC-N) sono potenti strumenti per modellare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in vitro e forniscono un paradigma traslazionale per le strategie di scoperta di farmaci1. I ricercatori hanno dimostrato che la co-coltura di hiPSC-A con hiPSC-N migliora la maturazione morfologica, molecolare, elettrofisiologica e farmacologica di entrambi i tipi di cellule, generando complesse reti neuronali e interazioni astrocita-neurone che assomigliano alle loro controparti in vivo 2,3. Simili esperimenti di co-coltura possono ricapitolare i segni distintivi della patobiologia della SLA come la neurotossicità mediata dagli astrociti 4,5 e l’ipereccitabilità neuronale6. Inoltre, con i progressi nei protocolli di differenziazione, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) possono essere differenziate in sottotipi neurali specifici a livello regionale, tra cui hiPSC-A e hiPSC-N 7,8 del midollo spinale e corticale. Queste strategie forniscono il potenziale per modellare la patologia del motoneurone corticale e spinale nella SLA, nonché l’influenza astrocitaria su entrambi. Tuttavia, ciò richiede che esista un saggio funzionale riproducibile per determinare questi effetti.
Recentemente è stato dimostrato che la registrazione multi-electrode array (MEA) è particolarmente adatta per la caratterizzazione elettrofisiologica di co-colture neurone-astrocitario2. A differenza delle analisi elettrofisiologiche a singola cellula, questi array di elettrodi ad alta densità registrano passivamente i potenziali di campo extracellulare da grandi popolazioni di neuroni senza interrompere le condizioni di coltura e preservare l’integrità delle membrane cellulari. Queste piattaforme sono particolarmente utili per registrare l’attività cellulare e di rete delle colture nel tempo e in risposta alla manipolazione farmacologica. Infine, quando la presenza di astrociti è una variabile di coltura, le registrazioni MEA possono fornire informazioni funzionali sulle interazioni bidirezionali astrocita-neurone 2,9.
Presentato qui è un protocollo ottimizzato per la differenziazione di hiPSC in hiPSC-A del midollo spinale e hiPSC-motoneuroni (MN) che è stato precedentemente convalidato2. Il protocollo di differenziazione hiPSC-A del midollo spinale produce costantemente colture di astrociti, che sono positive per la proteina B legante il calcio S100 (S100β), la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e l’omeobox B4 (HOXB4) fino all’80%, 50% e 90% delle cellule, rispettivamente, indicando una specifica della maturazione gliale e del midollo spinale 2,10 . Il protocollo di differenziazione hiPSC-MN genera neuroni che sono positivi al >90% per la colina acetiltransferasi (ChAT), suggerendo un’identità matura del neurone alfa-motorio2. Inoltre, il protocollo descrive le tecniche per la generazione di co-colture hiPSC-A/MN precedentemente dimostrate per produrre neuroni con maggiore complessità morfologica mediante analisi Scholl e microscopia immunofluorescente rispetto a colture neuronali senza astrociti o con astrociti roditori2. Mentre queste descrizioni sono specifiche per il midollo spinale hiPSC-A e hiPSC-N, un vantaggio unico è che la coltura indipendente iniziale di astrociti e neuroni seguita da passaggi di co-coltura in momenti successivi può essere tradotta per studiare gli effetti delle interazioni neurone-astrocita da altre regioni specifiche e cellule specifiche della malattia 7,8 . Infine, il protocollo descrive come coltivare queste colture su piastre MEA in modo che l’attività funzionale come fattore di composizione della co-coltura possa essere studiata nel tempo con la capacità di manipolare la composizione cellulare e le condizioni di coltura.
L’obiettivo di questi protocolli è quello di fornire un saggio funzionale per studiare le interazioni astrocita-neurone, esaminare i cambiamenti specifici della malattia e testare farmaci con potenziale terapeutico nel campo della SLA. Vengono fornite istruzioni video per i passaggi più impegnativi di questo protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ad oggi, i metodi basati su hiPSC e MEA per le registrazioni elettrofisiologiche di co-colture astrocita-neurone hanno trovato un’applicazione limitata nel campo della SLA6 e ancora non in piattaforme completamente umane, in contrasto con il loro uso più diffuso per la modellazione in vitro dell’epilessia9. Questa piattaforma, tuttavia, ha il potenziale per affrontare questioni fisiopatologicamente rilevanti nella ricerca sulla SLA, come i meccanismi di ipereccita…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo manoscritto è stato supportato da quanto segue: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH / NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Ringraziamo il Dr. Raha Dastgheyb e il Dr. Norman Haughey per aver fornito la piattaforma MEA e il software di analisi dei dati che abbiamo utilizzato per convalidare la piattaforma elettrofisiologica descritta. Vorremmo ringraziare Khalil Rust per la loro assistenza con la dimostrazione del protocollo e le riprese.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
Riferimenti
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