Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione su larga scala di vettori AAV di grado di ricerca utilizzando cellule HEK 293 aderenti coltivate in pile cellulari e purificazione cromatografica di affinità. Questo protocollo produce costantemente >1 x 1013 genomi vettoriali / mL, fornendo quantità vettoriali appropriate per studi su animali di grandi dimensioni.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I vettori del virus adeno-associato (AAV) sono tra i vettori di terapia genica clinicamente più avanzati, con tre terapie geniche AAV approvate per l'uomo. Il progresso clinico di nuove applicazioni per AAV comporta la transizione da piccoli modelli animali, come topi, a modelli animali più grandi, tra cui cani, pecore e primati non umani. Uno dei limiti della somministrazione di AAV ad animali più grandi è il requisito di grandi quantità di virus ad alto titolo. Mentre la coltura cellulare in sospensione è un metodo scalabile per la produzione di vettori AAV, pochi laboratori di ricerca hanno l'attrezzatura (ad esempio, bioreattori) o sanno come produrre AAV in questo modo. Inoltre, i titoli AAV sono spesso significativamente più bassi se prodotti in sospensione hek 293 celle rispetto alle celle HEK293 aderenti. Qui è descritto un metodo per produrre grandi quantità di AAV ad alto titolo utilizzando pile di celle. Vengono inoltre descritti un protocollo dettagliato per il titolo AAV e metodi per convalidare la purezza del vettore. Infine, vengono presentati i risultati rappresentativi dell'espressione transgenica mediata da AAV in un modello di pecora. Questo protocollo ottimizzato per la produzione su larga scala di vettori AAV in cellule aderenti consentirà ai laboratori di biologia molecolare di far progredire la sperimentazione delle loro nuove terapie AAV in modelli animali più grandi.
Introduzione
La terapia genica che utilizza vettori di virus adeno-associati (AAV) ha fatto passi da gigante negli ultimi tre decenni1,2. I miglioramenti dimostrati in una vasta gamma di malattie genetiche, tra cui cecità congenita, emofilia e malattie del sistema muscolo-scheletrico e del sistema nervoso centrale, hanno portato la terapia genica AAV in prima linea nella ricerca clinica3,4. Nel 2012, l'Agenzia europea per i medicinali (EMA) ha approvato Glybera, un vettore AAV1 che esprime lipoproteina lipasi (LPL) per il trattamento del deficit di LPL, rendendolo ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Doppia trasfezione plasmidica di cellule HEK293 in pile cellulari
- Scongelare un crio-flaconcino di cellule HEK293 in un bagno di perline fissato a 37 °C.
NOTA: DMEM completo preriscaldato a 37 °C durante lo scongelamento delle celle per garantire che la temperatura fredda non urti le celle durante la placcatura. Assicurarsi che le cellule abbiano un basso numero di passaggi, idealmente inferiore a 20, per garantire una crescita ottimale e un'efficienza di trasfezione. Assicurarsi che le cellule siano certificate per essere prive di micoplasma. - Trasferire il contenuto del crio-flaconcino a goccia in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La traduzione da modelli di piccoli roditori a modelli animali più grandi e l'eventuale applicazione clinica rappresentano una sfida significativa a causa della grande quantità di AAV necessaria per trasdurre animali più grandi e ottenere effetti terapeutici. Per confrontare l'efficienza di trasduzione del capside AAV6.2FF progettato razionalmente, precedentemente dimostrato un aumento di 101 volte dell'efficienza di trasduzione nelle cellule muscolari murine rispetto ad AAV63,topi, criceti e agne.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La produzione di vettori AAV ricombinanti (rAAV) descritti in questo documento utilizza materiali, reagenti e attrezzature comuni presenti nella maggior parte dei laboratori e delle strutture di ricerca di biologia molecolare. Questo documento consente al lettore di produrre rAAV di alta qualità in vitro e in vivo. Soprattutto, questo protocollo per la produzione di rAAV, rispetto ai protocolli più noiosi che coinvolgono la purificazione del cloruro di cesio, è efficiente ed evita l'uso dell'ultracentri.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Sarah K. Wootton è un inventore di un brevetto statunitense US10806802B2 per il capside AAV6.2FF.
Ringraziamenti
Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas e Jacob G. E. Yates hanno ricevuto stipendi per studenti dell'Ontario Veterinary College e borse di studio per laureati dell'Ontario. Amira D. Rghei è stata la destinataria di un Mitacs Accelerate Studentship. Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (# 66009) e da una sovvenzione Collaborative Health Research Projects (NSERC partnered) (# 433339) a SKW.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m filtro | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0,25% Tripsina | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanolo | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare guanti |
| Cellstack a 10 camere | Corning | 3271 | |
| Flacone PETG da 1 litro | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| Soluzione di acrilammide/Bis al 30% | Bio-Rad | 1610158 | |
| Piastra con gonna a 96 pozzetti | FroggaBio | FS-96 | |
| Guarnizioni per piastre adesive | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Persolfato di ammonio (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare guanti |
| Kit per la pulizia del sangue e dei tessuti | Qiagen | 69506 | Utilizzare per la pulizia del DNA nella sezione 4.6 del protocollo |
| Blu di bromofenolo | Fisher Scientific | B392-5 | ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare i guanti |
| Piastre per colture cellulari | Greiner bio-one | 7000232 | piastre da 15 cm |
| Provetta conica per coltura | Thermo Fisher Scientific | 339650 | Provetta conica da 15 mL |
| Provetta conica per coltura | Fisher Scientific | 14955240 | Provetta conica da 50 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con 1000 mg/L di D-glucosio, L-glutammina | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrato | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Etanolo | Greenfield | P016EA95 | Diluire l'alcol etilico (95% vol) al 20% per la sezione 3.7.4 e al 70% per la sezione 6.1.1.1 |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Acido acetico glaciale | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTELA. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare i guanti |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS con Mg2+ e Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS senza Mg2+ e Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| Cellule HEK293 | Collezione americana di colture tissutali | CRL-1573 | Al ricevimento, scongelare le cellule e la coltura come descritto nel . Una volta che le cellule sono state minimamente passate e stanno crescendo bene, congelare una sottofrazione per il futuro in aliquote e immagazzinarle in azoto liquido. Utilizzare sempre le celle al di sotto del passaggio numero 30. Una volta che le cellule coltivate sono state passate più di 30 volte, si consiglia di riavviare una coltura dalle aliquote conservate |
| HEK293 kit ELISA per la proteina della cellula ospite | Cygnus | Technologies F650S | Segui il produttore s istruzioni |
| Colonna di solfato di eparina | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutammina (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Cuscino di supporto per provette da centrifuga di grande volume | Corning | CLS431124 | Il cuscino di supporto deve essere utilizzato con provette da centrifuga di grande volume a meno che il rotore della centrifuga non abbia i cuscini con fondo a V appropriati Provette |
| centrifuga di grande volume | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Provetta per microcentrifuga | Fisher Scientific | 05-408-129 | Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, sterilizzare prima dell'uso |
| Acqua di grado molecolare | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroilsarcosina sale sodico | Sigma Aldrich | L5125 | ATTENZIONE. Indossare guanti |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific BP35810 | ||
| Optimem, siero ridotto medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilizzare prima dell'uso |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Diluire a 1x per l'uso su cellule |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| plasmide pHelper | Design de novo o ottenuto dal deposito di plasmidi | NA | |
| Bacino di pipette | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Acquisto di bacinelle per pipette sterili |
| Etere di polietilenglicole terz-ottilfenile (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | ATTENZIONE. Indossare guanti |
| Polietilenimmina (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Seguire il produttore' per produrre una soluzione da 1 litro. 0,22μ m filtrare e conservare a 4 gradi C |
| Piastra PCR semi-gonna in polipropilene | FroggaBio | WS-96 | |
| Polisorbato 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | ATTENZIONE. Indossare guanti |
| membrana in polivinilidene difluoruro (PVDF), | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Utilizzare una pinza per manipolare. Indossare i guanti. |
| Anticorpo primario | Progen | 65158 | |
| Scala proteica | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinasi K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| plasmide pTrangene | Design de novo o ottenuto da un deposito di plasmidi | NA | Deve contenere SV40 polyA nel genoma per essere compatibile con la titolazione AAV nella sezione 5.0 |
| Tubo della pompa | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Ottimizza la lunghezza del tubo e il contenimento del virus nelle frazioni E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Tampone di reazione | Promega | M6101 | Uso a concentrazione 10x nel protocollo dalla sezione 4.0 |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| Campione diluente | Cygnus Technologies | I700 | Deve essere acquistato separatamente per l'uso con il kit |
| ELISA per la proteina della cellula ospite HEK293Anticorpo secondario, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Latte scremato in polvere | Ossoide | LP0033B | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare guanti |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Utilizzare la sequenza nella Tabella X per la citazione da IDT per la sintesi | |
| Tetrametiletilendiammina (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare i guanti |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K deve essere utilizzato, in quanto ha un cutoff di 10000 peso molecolare |
| Nucleasi universale per la lisi cellulare | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoetanolo | Fisher Scientific | 21985023 | ATTENZIONE. Utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Indossare i guanti |
| ATTENZIONE: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per le linee guida sull'uso di sostanze chimiche pericolose. |
Riferimenti
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
