El estudio describe un protocolo para crear grandes cantidades (μg-mg) de ADN para campañas de detección de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sin clonar ni usar células vivas. La plantilla mínima se digiere y circula enzimáticamente y luego se amplifica mediante amplificación de círculo de rodadura isotérmica. Las reacciones de expresión libre de células podrían realizarse con el producto no purificado.
Este protocolo describe el diseño de una plantilla de ADN mínima y los pasos para la amplificación enzimática, lo que permite la creación rápida de prototipos de proteínas ensayables en menos de 24 h utilizando la expresión libre de células. Después de recibir ADN de un proveedor, el fragmento de gen es amplificado por PCR, cortado, circularizado y crio-almacenado. Una pequeña cantidad del ADN almacenado se diluye y amplifica significativamente (hasta 106x) utilizando la amplificación isotérmica del círculo rodante (RCA). RCA puede producir cantidades de microgramos de la plantilla de expresión mínima a partir de niveles de picogramos de material de partida (niveles de mg si se utiliza todo el fragmento sintético inicial). En este trabajo, una cantidad inicial de 20 pg resultó en 4 μg del producto final. El producto RCA resultante (concatemer de la plantilla mínima) se puede agregar directamente a una reacción libre de células sin pasos de purificación. Debido a que este método está completamente basado en PCR, puede permitir futuros esfuerzos de detección de alto rendimiento cuando se combina con sistemas automatizados de manejo de líquidos.
La expresión génica libre de células (CFE) ha surgido como una herramienta poderosa con muchas aplicaciones. Tales aplicaciones incluyen detección de enfermedades1,2,3,4,5,6, detección de micronutrientes y moléculas pequeñas7,8,9,10, 11,12, biofabricación13,14,15,16,17 ,18, educación19,20,21, fabricación de proteínasdifíciles 17,22,23,24,25,26,27, y detección devariantes 23,28,29,30,31,32 ,33. Esto se debe a la naturaleza abierta de los sistemas libres de células y la flexibilidad que confieren. Muchos grandes artículos de revisión ofrecen educación histórica y perspectivas futuras sobre la tecnología34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44.
Una reacción típica libre de células consta de tres componentes principales: extracto celular, mezcla de energía y plantilla genética. El extracto de célula activa contiene toda la maquinaria necesaria para la transcripción y traducción (TXTL) y se puede procesar de diversas maneras36. Los intermedios glicolíticos, electrolitos, aminoácidos y cofactores en la combinación de energía apoyan el proceso TXTL. Es una fuente importante de variabilidad en experimentos libres de células45 y se puede preparar de muchas maneras34,46. La preparación de la plantilla genética ha visto menos mejoras ya que los métodos tradicionales de clonación dan como resultado plásmidos con excelentes características de expresión. La desventaja de estos métodos tradicionales es el tiempo de respuesta y la cantidad de experiencia biológica necesaria para construirlos y propagarlos. Los esfuerzos de optimización recientes han dado como resultado flujos de trabajo simples de 24 horas para la preparación de extractoscelulares 47,48 que se pueden realizar en paralelo con la preparación de la mezcla energética49,50. Sin embargo, la clonación tradicional agrega varios días a la línea de tiempo de creación de prototipos de CFE (Tabla 1)23. Los productos de PCR rápidamente amplificados a partir del fragmento de gen comercial se pueden usar directamente51, pero esto limita el número de experimentos de prototipado ya que solo se produce 1 μg de ADN, lo que corresponde a aproximadamente cinco reacciones (volúmenes tradicionales de 15 μL). Con estos pasos adicionales de circularización y amplificación isotérmica, es posible cantidades superiores a miligramos del ADN (~ 5,000 reacciones por 1 mg). Esto aumenta drásticamente el número de pruebas que se pueden realizar en el cribado de alto rendimiento de proteínas o redes enzimáticas combinatorias (ingeniería metabólica libre de células); también permite la preservación efectiva de la biblioteca de plantillas lineales como ADN de alta concentración. Además, se necesitaría una mayor cantidad de plantilla para crear prototipos de grandes cantidades de proteínas necesarias para aplicaciones de ciencia de materiales (fibras e hidrogeles a base de proteínas). Algunas limitaciones de las plantillas lineales se pueden superar mediante el uso de un extracto de BL21 DE3 Star o el uso de métodos recientemente descubiertos para proteger las plantillas lineales de la degradación52,53,54. Sin embargo, esto no aborda el hecho de tener existencias limitadas de ADN producido por el proveedor para la amplificación por PCR o la cuestión de la experiencia biológica y el equipo necesario para la clonación.
Este trabajo presenta un protocolo diseñado explícitamente para aumentar la cantidad de plantilla de expresión que se puede obtener de pequeñas cantidades de fragmentos de genes producidos por el proveedor (típicamente 500-1000 ng de polvo liofilizado). El método descrito no requiere las habilidades necesarias para realizar la clonación tradicional en plásmidos o la transformación y propagación en células vivas. Al recibir un fragmento de gen por correo, un usuario puede producir suficientes plantillas para muchas reacciones libres de células mediante el empleo de amplificación isotérmica del círculo rodante (RCA) (Figura 1)23. Si bien la cantidad de ADN recibida del proveedor puede ser suficiente para los esfuerzos de detección limitados, se agota rápidamente y la recompra de fragmentos de genes lleva mucho tiempo y es costosa. El método también es especialmente adecuado para genes que son tóxicos y difíciles de clonar en E. coli.
El gen de interés puede ser cualquier proteína deseada, pero es mejor comenzar con una proteína fluorescente como un reportero conveniente para la lectura en tiempo real o de punto final en un lector de placas de pozo para los nuevos adoptantes de este método. Para nuevas secuencias de proteínas, copie la secuencia de aminoácidos de la proteína deseada y péguela en la herramienta de optimización de codones deseada61,62. Por lo general, hay muchos organis…
The authors have nothing to disclose.
Los autores reconocen a NIH 1R35GM138265-01 y NSF 2029532 por el apoyo parcial de este proyecto.
Alaline | Formedium | DOC0102 | |
Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
Arginine | Formedium | DOC0106 | |
Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
CMP | Sigma | C1006 | |
Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
dNTPs | NEB | N0447 | |
E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
Gene Fragment | IDT | ||
Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
Glycine | Formedium | DOC0138 | |
GMP | Sigma | G8377 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
HindIII-HF | NEB | R3104L | |
Histidine | Formedium | DOC0142 | |
Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
Leucine | Formedium | DOC0154 | |
Lysine | Formedium | DOC0158 | |
Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
Methionine | Formedium | DOC0166 | |
Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
NAD | Sigma | N8535 | |
NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
Proline | Formedium | DOC0174 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Serine | Formedium | DOC0178 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
Threonine | Formedium | DOC0182 | |
Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
UMP | Sigma | U6375 | |
Valine | Formedium | DOC0194 |