وتصف الدراسة بروتوكولا لإنشاء كميات كبيرة من الحمض النووي (ميكروغرام ملغ) لحملات فحص البروتين من شظايا الجينات الاصطناعية دون استنساخ أو استخدام الخلايا الحية. يتم هضم القالب الحد الأدنى بشكل انزيمي وتعميمها ثم تضخيمها باستخدام تضخيم دائرة المتداول isothermal. يمكن إجراء ردود فعل التعبير الخالي من الخلايا مع المنتج غير المتحقق منه.
يصف هذا البروتوكول تصميم قالب الحمض النووي الأدنى وخطوات التضخيم الأنزيمي ، مما يتيح النماذج الأولية السريعة للبروتينات القابلة للقول في أقل من 24 ساعة باستخدام التعبير الخالي من الخلايا. بعد تلقي الحمض النووي من بائع ، يتم تضخيم جزء الجين PCR ، وقطع ، وتعميمها ، والتبريد المصرفية. ثم يتم تخفيف كمية صغيرة من الحمض النووي المصرفية وتضخيمها بشكل كبير (تصل إلى 106× ) باستخدام تضخيم دائرة المتداول isothermal (RCA). RCA يمكن أن تسفر عن كميات ميكروغرام من قالب التعبير الحد الأدنى من مستويات بيكوغرام من المواد بدءا (مستويات ملغ إذا تم استخدام كل جزء الاصطناعية بدءا). في هذا العمل، أدى مبلغ يبدأ من 20 pg في 4 ميكروغرام من المنتج النهائي. يمكن إضافة منتج RCA الناتج (سلسلة من القالب الأدنى) مباشرة إلى رد فعل خال من الخلايا دون خطوات تنقية. ونظرا إلى أن هذه الطريقة تعتمد كليا على PCR، فقد تمكن من بذل جهود فحص عالية الإنتاجية في المستقبل عندما تقترن بأنظمة مناولة السائل الآلي.
وقد برز التعبير الجيني الخالي من الخلايا (CFE) كأداة قوية مع العديد من التطبيقات. وتشمل هذه التطبيقات الكشف عن الأمراض1،2،3،4،5،6، المغذيات الدقيقة والكشف عن الجزيئات الصغيرة7،8،9،10،11،12، الكتلة الحيوية13،14،15،16،17 ,18, التعليم19,20,21, تصنيع البروتينات الصعبة17,22,23,24,25,26,27, وفرز المتغير23,28,29,30,31,32 ,33. ويرجع ذلك إلى الطبيعة المفتوحة للأنظمة الخالية من الخلايا والمرونة التي تمنحها. العديد من المقالات استعراض كبير تقديم التعليم التاريخي ووجهات النظر المستقبلية على التكنولوجيا34،35،36،37،38،39،40،41،42،43،44.
يتكون التفاعل النموذجي الخالي من الخلايا من ثلاثة مكونات رئيسية: استخراج الخلايا ومزيج الطاقة والقالب الوراثي. استخراج الخلية النشطة يحتوي على جميع الآلات اللازمة للنسخ والترجمة (TXTL) ويمكن معالجتها في مجموعة متنوعة من الطرق36. وسيطة جليكوليتيك، الشوارد، الأحماض الأمينية، والعوامل المساعدة في مزيج الطاقة دعم عملية TXTL. وهو مصدر رئيسي للتغير في التجارب الخالية من الخلايا45 ويمكن إعدادها بطرق عديدة34،46. وقد شهد إعداد القالب الجيني تحسينات أقل لأن أساليب الاستنساخ التقليدية تؤدي إلى البلازميدات ذات الخصائص التعبيرية الممتازة. والجانب السلبي لهذه الأساليب التقليدية هو وقت التحول ومقدار الخبرة البيولوجية اللازمة لبنائها ونشرها. وقد أسفرت جهود التحسين الأخيرة في سير العمل بسيطة 24 ساعة لإعداد استخراج الخلية47،48 التي يمكن القيام بها بالتوازي مع إعداد مزيج الطاقة49،50. ومع ذلك، يضيف الاستنساخ التقليدي عدة أيام إلى الجدول الزمني للنماذج الأولية CFE (الجدول 1)23. يمكن استخدام منتجات PCR المضخمة بسرعة من جزء الجينات التجارية مباشرة51، ولكن هذا يحد من عدد تجارب النماذج الأولية حيث يتم إنتاج 1 ميكروغرام فقط من الحمض النووي ، وهو ما يتوافق مع ما يقرب من خمسة ردود فعل (أحجام 15 ميكرولتر التقليدية). مع هذه الخطوات الإضافية من التعميم والتضخيم isothermal، أكبر من كميات ملليغرام من الحمض النووي ممكن (~ 5000 ردود الفعل ل1 ملغ). وهذا يزيد بشكل كبير من عدد الاختبارات التي يمكن إجراؤها في فحص عالي الإنتاجية للبروتينات أو شبكات الإنزيمات الجمعية (الهندسة الأيضية الخالية من الخلايا)؛ كما أنه يسمح للحفاظ الفعال على مكتبة القالب الخطي كما الحمض النووي تركيز عالية. وعلاوة على ذلك، سيكون من الضروري زيادة كمية القالب لنماذج أولية لكميات أكبر من البروتين اللازمة لتطبيقات علوم المواد (الألياف القائمة على البروتين والهيدروجلز). يمكن التغلب على بعض القيود من القوالب الخطية باستخدام استخراج من BL21 DE3 ستار أو باستخدام أساليب اكتشفت مؤخرا لحماية القوالب الخطية من تدهور52،53،54. بيد أن هذا لا يتناول وجود مخزونات محدودة من الحمض النووي المنتج من قبل البائعين من أجل تضخيم ال PCR أو مسألة الخبرة البيولوجية والمعدات اللازمة للاستنساخ.
يقدم هذا العمل بروتوكولا مصمما بشكل صريح لزيادة كمية قالب التعبير التي يمكن الحصول عليها من كميات صغيرة من شظايا الجينات المنتجة من قبل البائع (عادة 500-1000 نانوغرام من مسحوق الليوفيلي). ولا تتطلب الطريقة الموصوفة المهارات اللازمة لإجراء الاستنساخ التقليدي في البلازميدات أو التحول والانتشار في الخلايا الحية. عند تلقي جزء الجينات في البريد، يمكن للمستخدم إنتاج ما يكفي من القوالب للعديد من ردود الفعل الخالية من الخلايا عن طريق توظيف تضخيم دائرة المتداول isothermal (RCA) (الشكل 1)23. وفي حين أن كمية الحمض النووي الواردة من البائع قد تكون كافية لجهود الفحص المحدودة، فإنها تنفد بسرعة، وإعادة شراء شظايا الجينات تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. هذه الطريقة هي أيضا مناسبة بشكل خاص للجينات التي هي سامة ويصعب استنساخها في الإشريكية القولونية.
الجين من الفائدة يمكن أن يكون أي البروتين المطلوب، ولكن من الأفضل أن تبدأ مع بروتين الفلورسنت كمراسل مريحة للقراءة في الوقت الحقيقي أو نهاية نقطة على قارئ لوحة جيدا لمتبنين جدد لهذه الطريقة. لتسلسل البروتين الجديد، نسخ تسلسل الأحماض الأمينية من البروتين المطلوب ولصقه في أداة التحسين كود?…
The authors have nothing to disclose.
يقر المؤلفان بأن NIH 1R35GM138265-01 وNSF 2029532 للحصول على دعم جزئي لهذا المشروع.
Alaline | Formedium | DOC0102 | |
Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
Arginine | Formedium | DOC0106 | |
Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
CMP | Sigma | C1006 | |
Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
dNTPs | NEB | N0447 | |
E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
Gene Fragment | IDT | ||
Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
Glycine | Formedium | DOC0138 | |
GMP | Sigma | G8377 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
HindIII-HF | NEB | R3104L | |
Histidine | Formedium | DOC0142 | |
Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
Leucine | Formedium | DOC0154 | |
Lysine | Formedium | DOC0158 | |
Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
Methionine | Formedium | DOC0166 | |
Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
NAD | Sigma | N8535 | |
NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
Proline | Formedium | DOC0174 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Serine | Formedium | DOC0178 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
Threonine | Formedium | DOC0182 | |
Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
UMP | Sigma | U6375 | |
Valine | Formedium | DOC0194 |