JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

طرق سريعة انزيمية لتضخيم الحد الأدنى من القوالب الخطية لنماذج البروتين باستخدام أنظمة خالية من الخلايا

Published: June 14, 2021
doi:
10.3791/62728
,
1Chemical and Biological Engineering,Iowa State University

Summary

وتصف الدراسة بروتوكولا لإنشاء كميات كبيرة من الحمض النووي (ميكروغرام ملغ) لحملات فحص البروتين من شظايا الجينات الاصطناعية دون استنساخ أو استخدام الخلايا الحية. يتم هضم القالب الحد الأدنى بشكل انزيمي وتعميمها ثم تضخيمها باستخدام تضخيم دائرة المتداول isothermal. يمكن إجراء ردود فعل التعبير الخالي من الخلايا مع المنتج غير المتحقق منه.

Abstract

يصف هذا البروتوكول تصميم قالب الحمض النووي الأدنى وخطوات التضخيم الأنزيمي ، مما يتيح النماذج الأولية السريعة للبروتينات القابلة للقول في أقل من 24 ساعة باستخدام التعبير الخالي من الخلايا. بعد تلقي الحمض النووي من بائع ، يتم تضخيم جزء الجين PCR ، وقطع ، وتعميمها ، والتبريد المصرفية. ثم يتم تخفيف كمية صغيرة من الحمض النووي المصرفية وتضخيمها بشكل كبير (تصل إلى 106× ) باستخدام تضخيم دائرة المتداول isothermal (RCA). RCA يمكن أن تسفر عن كميات ميكروغرام من قالب التعبير الحد الأدنى من مستويات بيكوغرام من المواد بدءا (مستويات ملغ إذا تم استخدام كل جزء الاصطناعية بدءا). في هذا العمل، أدى مبلغ يبدأ من 20 pg في 4 ميكروغرام من المنتج النهائي. يمكن إضافة منتج RCA الناتج (سلسلة من القالب الأدنى) مباشرة إلى رد فعل خال من الخلايا دون خطوات تنقية. ونظرا إلى أن هذه الطريقة تعتمد كليا على PCR، فقد تمكن من بذل جهود فحص عالية الإنتاجية في المستقبل عندما تقترن بأنظمة مناولة السائل الآلي.

Introduction

وقد برز التعبير الجيني الخالي من الخلايا (CFE) كأداة قوية مع العديد من التطبيقات. وتشمل هذه التطبيقات الكشف عن الأمراض1،2،3،4،5،6، المغذيات الدقيقة والكشف عن الجزيئات الصغيرة7،8،9،10،11،12، الكتلة الحيوية13،14،15،16،17 ,18, التعليم19,20,21, تصنيع البروتينات الصعبة17,22,23,24,25,26,27, وفرز المتغير23,28,29,30,31,32 ,33. ويرجع ذلك إلى الطبيعة المفتوحة للأنظمة الخالية من الخلايا والمرونة التي تمنحها. العديد من المقالات استعراض كبير تقديم التعليم التاريخي ووجهات النظر المستقبلية على التكنولوجيا34،35،36،37،38،39،40،41،42،43،44.

يتكون التفاعل النموذجي الخالي من الخلايا من ثلاثة مكونات رئيسية: استخراج الخلايا ومزيج الطاقة والقالب الوراثي. استخراج الخلية النشطة يحتوي على جميع الآلات اللازمة للنسخ والترجمة (TXTL) ويمكن معالجتها في مجموعة متنوعة من الطرق36. وسيطة جليكوليتيك، الشوارد، الأحماض الأمينية، والعوامل المساعدة في مزيج الطاقة دعم عملية TXTL. وهو مصدر رئيسي للتغير في التجارب الخالية من الخلايا45 ويمكن إعدادها بطرق عديدة34،46. وقد شهد إعداد القالب الجيني تحسينات أقل لأن أساليب الاستنساخ التقليدية تؤدي إلى البلازميدات ذات الخصائص التعبيرية الممتازة. والجانب السلبي لهذه الأساليب التقليدية هو وقت التحول ومقدار الخبرة البيولوجية اللازمة لبنائها ونشرها. وقد أسفرت جهود التحسين الأخيرة في سير العمل بسيطة 24 ساعة لإعداد استخراج الخلية47،48 التي يمكن القيام بها بالتوازي مع إعداد مزيج الطاقة49،50. ومع ذلك، يضيف الاستنساخ التقليدي عدة أيام إلى الجدول الزمني للنماذج الأولية CFE (الجدول 1)23. يمكن استخدام منتجات PCR المضخمة بسرعة من جزء الجينات التجارية مباشرة51، ولكن هذا يحد من عدد تجارب النماذج الأولية حيث يتم إنتاج 1 ميكروغرام فقط من الحمض النووي ، وهو ما يتوافق مع ما يقرب من خمسة ردود فعل (أحجام 15 ميكرولتر التقليدية). مع هذه الخطوات الإضافية من التعميم والتضخيم isothermal، أكبر من كميات ملليغرام من الحمض النووي ممكن (~ 5000 ردود الفعل ل1 ملغ). وهذا يزيد بشكل كبير من عدد الاختبارات التي يمكن إجراؤها في فحص عالي الإنتاجية للبروتينات أو شبكات الإنزيمات الجمعية (الهندسة الأيضية الخالية من الخلايا)؛ كما أنه يسمح للحفاظ الفعال على مكتبة القالب الخطي كما الحمض النووي تركيز عالية. وعلاوة على ذلك، سيكون من الضروري زيادة كمية القالب لنماذج أولية لكميات أكبر من البروتين اللازمة لتطبيقات علوم المواد (الألياف القائمة على البروتين والهيدروجلز). يمكن التغلب على بعض القيود من القوالب الخطية باستخدام استخراج من BL21 DE3 ستار أو باستخدام أساليب اكتشفت مؤخرا لحماية القوالب الخطية من تدهور52،53،54. بيد أن هذا لا يتناول وجود مخزونات محدودة من الحمض النووي المنتج من قبل البائعين من أجل تضخيم ال PCR أو مسألة الخبرة البيولوجية والمعدات اللازمة للاستنساخ.

يقدم هذا العمل بروتوكولا مصمما بشكل صريح لزيادة كمية قالب التعبير التي يمكن الحصول عليها من كميات صغيرة من شظايا الجينات المنتجة من قبل البائع (عادة 500-1000 نانوغرام من مسحوق الليوفيلي). ولا تتطلب الطريقة الموصوفة المهارات اللازمة لإجراء الاستنساخ التقليدي في البلازميدات أو التحول والانتشار في الخلايا الحية. عند تلقي جزء الجينات في البريد، يمكن للمستخدم إنتاج ما يكفي من القوالب للعديد من ردود الفعل الخالية من الخلايا عن طريق توظيف تضخيم دائرة المتداول isothermal (RCA) (الشكل 1)23. وفي حين أن كمية الحمض النووي الواردة من البائع قد تكون كافية لجهود الفحص المحدودة، فإنها تنفد بسرعة، وإعادة شراء شظايا الجينات تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. هذه الطريقة هي أيضا مناسبة بشكل خاص للجينات التي هي سامة ويصعب استنساخها في الإشريكية القولونية.

Protocol

1. تصميم جزء الجينات ملاحظة: يجب أن تحتوي جزء الجينات على جميع العناصر الوراثية اللازمة للنسخ/ الترجمة، بما في ذلك المروج وموقع الربط الريبوسوم (RBS) وبدء كودون وجين الفائدة والمنهي. بينما المنهي غير ضروري لقالب تعبير خطي (LET) ، سيكون من المهم إذا قرر المستخدم إدراج التسلسل في plasm…

Representative Results

التعبير عن sfGFP من قوالب RCA كان مماثلا لتلك التي من pJL1 plasmid عند استخدام فقط 0.30 ميكرولتر من الحمض النووي RCA غير مبور في رد فعل 15 ميكرولتر (الشكل 2A). في الواقع، مضاعفة ومضاعفة كمية القالب يبدو أن لا تقدم أي فائدة في استخراج نجمة DE3 BL21، مما يشير إلى مستويات مشبعة بالفعل من القالب في 0…

Discussion

الجين من الفائدة يمكن أن يكون أي البروتين المطلوب، ولكن من الأفضل أن تبدأ مع بروتين الفلورسنت كمراسل مريحة للقراءة في الوقت الحقيقي أو نهاية نقطة على قارئ لوحة جيدا لمتبنين جدد لهذه الطريقة. لتسلسل البروتين الجديد، نسخ تسلسل الأحماض الأمينية من البروتين المطلوب ولصقه في أداة التحسين كود?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يقر المؤلفان بأن NIH 1R35GM138265-01 وNSF 2029532 للحصول على دعم جزئي لهذا المشروع.

Materials

Alaline Formedium DOC0102
Ammonium glutamate MP Biomedicals MP21805951
Arginine Formedium DOC0106
Asparagine Formedium DOC0114
Aspartic Acid Formedium DOC0118
ATP Sigma A2383
Axygen Sealing Film Corning PCR-SP
CMP Sigma C1006
Coenzyme A Sigma C3144
CutSmart Buffer NEB B7204S Provided with HindIII
Cysteine Formedium DOC0122
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4004 Used for purifying DNA
dNTPs NEB N0447
E. coli tRNA Sigma (Roche) 10109541001
Folinic Acid Sigma 47612
Gene Fragment IDT
Glutamic Acid Formedium DOC0134
Glutamine Formedium DOC0130
Glycine Formedium DOC0138
GMP Sigma G8377
HEPES Sigma H3375
HindIII-HF NEB R3104L
Histidine Formedium DOC0142
Isoleucine Formedium DOC0150
Leucine Formedium DOC0154
Lysine Formedium DOC0158
Magnesium glutamate Sigma 49605
Methionine Formedium DOC0166
Microtiter Plate (384 well) Greiner 781906
Microtiter Plate (96 well) Greiner 655809
Multimode Plate Reader BioTek Synergy Neo2
NAD Sigma N8535
NanoPhotometer Implen NP80
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480
PCR Tube VWR 20170-012
Phenylalanine Formedium DOC0170
Phosphoenolpyruvate Sigma (Roche) 10108294
Potassium glutamate Sigma G1501
Potassium oxalate Fisher Scientific P273
Proline Formedium DOC0174
Putrescine Sigma P5780
Serine Formedium DOC0178
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification Kit Cytiva 25640010 Used for RCA
Thermal Cycler Biorad C1000 Touch
Thermoblock Eppendorf ThermoMixer FP
Threonine Formedium DOC0182
Tryptophan Formedium DOC0186
Tyrosine Formedium DOC0190
UMP Sigma U6375
Valine Formedium DOC0194
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  3. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  4. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
  5. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
  6. Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
  7. Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
  8. Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
  9. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  10. Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
  11. Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
  12. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  13. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  14. Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
  15. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  16. Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
  17. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
  20. Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
  21. Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
  22. Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  25. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
  26. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
  27. Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of “difficult-to-express” proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
  28. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
  29. Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
  30. Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
  31. Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
  32. Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
  33. Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
  34. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
  35. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  36. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  37. Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
  38. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  39. Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
  40. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  41. Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  42. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  43. Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
  44. Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
  45. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  46. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  47. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  48. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  49. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  50. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
  51. Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
  52. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  53. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
  54. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  55. . Addgene: pJL1 Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021)
  56. . IDT Codon Optimization Tool Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021)
  57. Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
  58. . New England Biolabs Tm Calculator Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021)
  59. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
  60. Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
  61. Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
  62. Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
  63. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
  64. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  65. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  66. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
  67. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).

Tags

Cell-free SystemsProtein PrototypingRolling Circle AmplificationPCRDNA TemplateRestriction DigestionDNA LigationEnzymatic Amplification
check_url/it/62728?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (172), e62728, doi:10.3791/62728 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image