De studie beschrijft een protocol voor het maken van grote (μg-mg) hoeveelheden DNA voor eiwitscreeningcampagnes uit synthetische genfragmenten zonder klonen of het gebruik van levende cellen. De minimale sjabloon wordt enzymatisch verteerd en gecicirkeld en vervolgens versterkt met behulp van isothermische rollende cirkelversterking. Celvrije expressiereacties konden worden uitgevoerd met het ongezuiverde product.
Dit protocol beschrijft het ontwerp van een minimale DNA-sjabloon en de stappen voor enzymatische amplificatie, waardoor snelle prototyping van testbare eiwitten in minder dan 24 uur mogelijk is met behulp van celvrije expressie. Na ontvangst van DNA van een leverancier wordt het genfragment PCR-versterkt, gesneden, gecirculiseerd en cryo-banked. Een kleine hoeveelheid van het gebankte DNA wordt vervolgens verdund en aanzienlijk versterkt (tot 106x) met behulp van isotherme rollende cirkelversterking (RCA). RCA kan microgramhoeveelheden van de minimale expressiesjabloon opleveren uit picogramniveaus van uitgangsmateriaal (mg-niveaus als alle beginnende synthetische fragmenten worden gebruikt). In dit werk resulteerde een starthoeveelheid van 20 pg in 4 μg van het eindproduct. Het resulterende RCA-product (aaneenschakeling van de minimale sjabloon) kan direct worden toegevoegd aan een celvrije reactie zonder zuiveringsstappen. Omdat deze methode volledig pcr-gebaseerd is, kan het toekomstige screeningsinspanningen met hoge doorvoer mogelijk maken in combinatie met geautomatiseerde vloeistofbehandelingssystemen.
Celvrije genexpressie (CFE) is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel met vele toepassingen. Dergelijke toepassingenomvatten ziektedetectie1,2,3,4,5,6,micronutriënten en detectie van kleinemoleculen 7,8,9,10,11,12,biomanufacturing13,14,15,16,17 ,18, onderwijs19,20,21, productie van moeilijke eiwitten17,22,23,24,25,26,27, en variant screening23,28,29,30,31,32 ,33. Dit komt door het open karakter van celvrije systemen en de flexibiliteit die ze bieden. Veel geweldige overzichtsartikelen bieden historisch onderwijs en toekomstperspectieven op de technologie34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.
Een typische celvrije reactie bestaat uit drie belangrijke componenten: celextract, energiemix en genetische sjabloon. Actief celextract bevat alle benodigde machines voor transcriptie en vertaling (TXTL) en kan op verschillende manieren worden verwerkt36. Glycolytische tussenproducten, elektrolyten, aminozuren en cofactoren in de energiemix ondersteunen het TXTL-proces. Het is een belangrijke bron van variabiliteit in celvrije experimenten45 en kan op vele manieren worden voorbereid34,46. De voorbereiding van de genetische sjabloon heeft minder verbeteringen ondergaan, omdat traditionele kloonmethoden resulteren in plasmiden met uitstekende expressiekenmerken. Het nadeel van deze traditionele methoden is de doorlooptijd en de hoeveelheid biologische expertise die nodig is om ze te bouwen en te vermeerderen. Recente optimalisatie-inspanningen hebben geresulteerd in eenvoudige 24-uurs workflows voor celextractbereiding47,48 die parallel met energiemixvoorbereiding49,50kunnen worden uitgevoerd. Traditioneel klonen voegt echter meerdere dagen toe aan de cfe prototyping tijdlijn (Tabel 1)23. Snel versterkte PCR-producten uit het commerciële genfragment kunnen direct worden gebruikt51, maar dit beperkt het aantal prototyping-experimenten omdat slechts 1 μg DNA wordt geproduceerd, wat overeenkomt met ongeveer vijf reacties (traditionele volumes van 15 μL). Met deze extra stappen van circularisatie en isotherme amplificatie is meer dan milligram hoeveelheden van het DNA mogelijk (~ 5.000 reacties voor 1 mg). Dit verhoogt drastisch het aantal tests dat kan worden uitgevoerd in high-throughput screening van eiwitten of combinatorische enzymnetwerken (celvrije metabole engineering); het zorgt ook voor een effectieve conservering van de lineaire sjabloonbibliotheek als DNA met hoge concentratie. Bovendien zou een grotere hoeveelheid sjabloon nodig zijn om grotere hoeveelheden eiwit te prototypen die nodig zijn voor materiaalwetenschappelijke toepassingen (op eiwitten gebaseerde vezels en hydrogels). Sommige beperkingen van lineaire sjablonen kunnen worden overwonnen door een uittreksel van BL21 DE3 Star te gebruiken of recent ontdekte methoden te gebruiken om lineaire sjablonen te beschermen tegen degradatie52,53,54. Dit heeft echter geen betrekking op het hebben van beperkte voorraden door de leverancier geproduceerd DNA voor PCR-amplificatie of de kwestie van biologische expertise en apparatuur die nodig is voor klonen.
Dit werk presenteert een protocol dat expliciet is ontworpen om de hoeveelheid expressiesjabloon te verhogen die kan worden verkregen uit kleine hoeveelheden door de leverancier geproduceerde genfragmenten (meestal 500-1000 ng gelyofiliseerd poeder). De beschreven methode vereist niet de vaardigheden die nodig zijn om traditioneel klonen in plasmiden uit te voeren of te transformeren en te vermeerderen in levende cellen. Na ontvangst van een genfragment in de post kan een gebruiker voldoende sjablonen produceren voor veel celvrije reacties door gebruik te maken van isotherme rollende cirkelversterking (RCA) (Figuur 1)23. Hoewel de hoeveelheid DNA die van de leverancier wordt ontvangen voldoende kan zijn voor beperkte screeningsinspanningen, is deze snel uitgeput en is het opnieuw kopen van genfragmenten tijdrovend en kostbaar. De methode is ook bijzonder geschikt voor genen die giftig en moeilijk te klonen zijn in E. coli.
Het gen van belang kan elk gewenst eiwit zijn, maar het is het beste om te beginnen met een fluorescerend eiwit als een handige verslaggever voor real-time of eindpuntuitlezing op een putplaatlezer voor nieuwe gebruikers van deze methode. Voor nieuwe eiwitsequenties kopieert u de aminozuursequentie van het gewenste eiwit en plakt u deze in de gewenste codonoptimalisatietool61,62. Er zijn meestal veel beschikbare organismen en stammen van E. coli in de co…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen NIH 1R35GM138265-01 en NSF 2029532 voor gedeeltelijke ondersteuning van dit project.
Alaline | Formedium | DOC0102 | |
Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
Arginine | Formedium | DOC0106 | |
Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
CMP | Sigma | C1006 | |
Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
dNTPs | NEB | N0447 | |
E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
Gene Fragment | IDT | ||
Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
Glycine | Formedium | DOC0138 | |
GMP | Sigma | G8377 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
HindIII-HF | NEB | R3104L | |
Histidine | Formedium | DOC0142 | |
Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
Leucine | Formedium | DOC0154 | |
Lysine | Formedium | DOC0158 | |
Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
Methionine | Formedium | DOC0166 | |
Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
NAD | Sigma | N8535 | |
NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
Proline | Formedium | DOC0174 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Serine | Formedium | DOC0178 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
Threonine | Formedium | DOC0182 | |
Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
UMP | Sigma | U6375 | |
Valine | Formedium | DOC0194 |