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Bioingegneria

सेल-फ्री सिस्टम का उपयोग करके प्रोटीन प्रोटोटाइप के लिए न्यूनतम, रैखिक टेम्पलेट्स के प्रवर्धन के लिए रैपिड, एंजाइमेटिक तरीके

Published: June 14, 2021
doi:
10.3791/62728
,
1Chemical and Biological Engineering,Iowa State University

Summary

अध्ययन क्लोनिंग या जीवित कोशिकाओं का उपयोग कर के बिना सिंथेटिक जीन के टुकड़े से प्रोटीन स्क्रीनिंग अभियानों के लिए डीएनए की बड़ी (μg-मिलीग्राम) मात्रा बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । न्यूनतम टेम्पलेट को एंजाइमेटिक रूप से पचाने और गोलाकार किया जाता है और फिर आइसोथर्मल रोलिंग सर्कल प्रवर्धन का उपयोग करके परिलक्षित किया जाता है। सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं को अशुद्ध उत्पाद के साथ किया जा सकता है।

Abstract

यह प्रोटोकॉल एक न्यूनतम डीएनए टेम्पलेट के डिजाइन और एंजाइमेटिक प्रवर्धन के लिए कदमों का वर्णन करता है, जिससे सेल-मुक्त अभिव्यक्ति का उपयोग करके 24 घंटे से कम समय में परकीय प्रोटीन की तेजी से प्रोटोटाइप को सक्षम किया जा सके। एक विक्रेता से डीएनए प्राप्त करने के बाद, जीन टुकड़ा पीसीआर-प्रवर्धित, कट, परिपत्रीकृत और क्रायो-बैंक है। बैंक डीएनए की एक छोटी राशि तो पतला और काफी परिलक्षित (106x तक) isothermal रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) का उपयोग कर रहा है । आरसीए शुरू सामग्री के पिकोग्राम स्तर से न्यूनतम अभिव्यक्ति टेम्पलेट की माइक्रोग्राम मात्रा प्राप्त कर सकता है (यदि सभी सिंथेटिक टुकड़े शुरू किया जाता है तो एमजी का स्तर)। इस काम में, 20 पीजी की शुरुआती राशि के परिणामस्वरूप अंतिम उत्पाद का 4 माइक्रोग्राम हुआ। परिणामस्वरूप आरसीए उत्पाद (न्यूनतम टेम्पलेट का संक्षिप्त) सीधे एक सेल-मुक्त प्रतिक्रिया में जोड़ा जा सकता है जिसमें कोई शुद्धिकरण कदम नहीं होता है। इस विधि के पूरी तरह से पीसीआर आधारित होने के कारण, यह स्वचालित तरल हैंडलिंग सिस्टम के साथ मिलकर भविष्य के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रयासों को सक्षम कर सकता है।

Introduction

सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति (CFE) कई अनुप्रयोगों के साथ एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। इस तरह के अनुप्रयोगों में रोग का पतालगाना 1,2,3,4,5,6,सूक्ष्म पोषक और छोटे अणु का पता7,8,9,10,11,12,बायोमैन्यूफैक्चरिंग13,14,15,16, 17 ,18,शिक्षा19,20,21, निर्माण कठिन प्रोटीन17,22, 23,24,25,26,27,और संस्करण स्क्रीनिंग23,28, 29,30, 31,32 ,33. यह सेल मुक्त प्रणालियों की खुली प्रकृति और उनके द्वारा प्रदान किए जाने वाले लचीलेपन के कारण है। कई महान समीक्षा लेख प्रौद्योगिकी 34,35, 36 , 36 , 37,38,39,40, 41,42,43,44पर ऐतिहासिक शिक्षा और भविष्य के दृष्टिकोण प्रदान करते हैं ।

एक विशिष्ट सेल-मुक्त प्रतिक्रिया में तीन प्रमुख घटक होते हैं: सेल एक्सट्रैक्ट, ऊर्जा मिश्रण और आनुवंशिक टेम्पलेट। सक्रिय सेल एक्सट्रैक्ट में ट्रांसक्रिप्शन और ट्रांसलेशन (TXTL) के लिए सभी आवश्यक मशीनरी होती है और इसे विभिन्न तरीकों से संसाधित किया जा सकता है36। ऊर्जा मिश्रण में ग्लाइसोलिटिक इंटरमीडिएट, इलेक्ट्रोलाइट्स, अमीनो एसिड और कोफैक्टर TXTL प्रक्रिया का समर्थन करते हैं। यह सेल मुक्त प्रयोगों में परिवर्तनशीलता का एक प्रमुख स्रोत हैऔर इसे कई तरीकों से तैयार किया जा सकता है34,46. आनुवंशिक टेम्पलेट की तैयारी में कम सुधार देखा गया है क्योंकि पारंपरिक क्लोनिंग विधियों के परिणामस्वरूप उत्कृष्ट अभिव्यक्ति विशेषताओं के साथ प्लाज्मिड होते हैं। इन पारंपरिक तरीकों के लिए नकारात्मक पक्ष बदलाव का समय और जैविक विशेषज्ञता की राशि के निर्माण और उन्हें प्रचारित करने के लिए आवश्यक है। हाल ही में अनुकूलन के प्रयासों के परिणामस्वरूप सेल निकालने की तैयारी के लिए 24 घंटे के कार्यप्रवाह सरल हुए हैं ,48जो ऊर्जा मिश्रण तैयारी49,50के समानांतर किए जा सकते हैं। हालांकि, पारंपरिक क्लोनिंग सीएफई प्रोटोटाइप टाइमलाइन(टेबल 1)23में कई दिन जोड़ती है। वाणिज्यिक जीन टुकड़े से जल्दी से परिलक्षित पीसीआर उत्पादों का उपयोग सीधे51किया जा सकता है, लेकिन यह प्रोटोटाइप प्रयोगों की संख्या को सीमित करता है क्योंकि डीएनए का केवल 1 माइक्रोग्राम उत्पादित होता है, जो लगभग पांच प्रतिक्रियाओं (पारंपरिक 15 माइक्रोन वॉल्यूम) से मेल खाता है। परिपत्रीकरण और आइसोथर्मल प्रवर्धन के इन अतिरिक्त चरणों के साथ, डीएनए की मिलीग्राम मात्रा से अधिक संभव है (1 मिलीग्राम के लिए ~ 5,000 प्रतिक्रियाएं)। यह नाटकीय रूप से प्रोटीन या संयोजन एंजाइम नेटवर्क (सेल-मुक्त मेटाबोलिक इंजीनियरिंग) की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग में किए जा सकने वाले परीक्षणों की संख्या को बढ़ाता है; यह उच्च एकाग्रता डीएनए के रूप में रैखिक टेम्पलेट पुस्तकालय के प्रभावी संरक्षण के लिए भी अनुमति देता है। इसके अलावा, सामग्री विज्ञान अनुप्रयोगों (प्रोटीन आधारित फाइबर और हाइड्रोगेल) के लिए आवश्यक प्रोटीन की बड़ी मात्रा को प्रोटोटाइप करने के लिए टेम्पलेट की बढ़ी हुई मात्रा आवश्यक होगी। Bl21 DE3 स्टार से एक उद्धरण का उपयोग करके या 52 , 53,54से रैखिक टेम्पलेट्स की रक्षा करने के लिए हाल ही में खोजे गए तरीकों का उपयोग करके रैखिक टेम्पलेट्स की कुछ सीमाओं को दूर किया जा सकता है। हालांकि, यह पीसीआर प्रवर्धन के लिए विक्रेता-उत्पादित डीएनए के सीमित स्टॉक या क्लोनिंग के लिए आवश्यक जैविक विशेषज्ञता और उपकरणों के मुद्दे का समाधान नहीं करता है ।

यह काम अभिव्यक्ति टेम्पलेट की मात्रा को बढ़ाने के लिए स्पष्ट रूप से डिज़ाइन किया गया एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसे विक्रेता-उत्पादित जीन टुकड़ों (आमतौर पर 500-1000 एनजी ल्योफिलाइज्ड पाउडर) से प्राप्त किया जा सकता है। वर्णित विधि को प्लाज्मिड में पारंपरिक क्लोनिंग करने या जीवित कोशिकाओं में बदलने और प्रचार करने के लिए आवश्यक कौशल की आवश्यकता नहीं होती है। मेल में जीन का टुकड़ा प्राप्त करने पर, एक उपयोगकर्ता आइसोथर्मल रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए)(चित्र 1)23को नियोजित करके कई सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त टेम्पलेट्स का उत्पादन कर सकता है। जबकि विक्रेता से प्राप्त डीएनए की मात्रा सीमित स्क्रीनिंग प्रयासों के लिए पर्याप्त हो सकता है, यह जल्दी समाप्त हो गया है, और फिर से जीन टुकड़े खरीद समय लेने वाली और महंगा है । विधि भी विशेष रूप से अच्छी तरह से जीन है कि विषाक्त और ई. कोलाईमें क्लोन करने के लिए मुश्किल कर रहे है के लिए अनुकूल है ।

Protocol

1. जीन टुकड़ा डिजाइनिंग नोट: जीन टुकड़ा प्रतिलेखन के लिए सभी आवश्यक आनुवंशिक तत्वों होना चाहिए/ जबकि टर्मिनेटर एक रैखिक अभिव्यक्ति टेम्पलेट (एलईओ) के लिए आवश्यक नहीं है, यदि उपयोगकर्ता अनुक्र?…

Representative Results

आरसीए टेम्पलेट्स से एसएफजीएफपी की अभिव्यक्ति पीजेएल1 प्लाज्मिड की तुलना में थी, जब 15 माइक्रोन प्रतिक्रिया(चित्रा 2 ए)में केवल 0.30 माइक्रोन अपस्फीकी आरसीए डीएनए का उपयोग करते समय। वास्तव में, ?…

Discussion

ब्याज का जीन किसी भी वांछित प्रोटीन हो सकता है, लेकिन इस विधि के नए अपनाने वालों के लिए एक अच्छी तरह से प्लेट रीडर पर वास्तविक समय या अंत बिंदु readout के लिए एक सुविधाजनक रिपोर्टर के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोट…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखक इस परियोजना के आंशिक समर्थन के लिए NIH 1R35GM138265-01 और एनएसएफ 2029532 को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Alaline Formedium DOC0102
Ammonium glutamate MP Biomedicals MP21805951
Arginine Formedium DOC0106
Asparagine Formedium DOC0114
Aspartic Acid Formedium DOC0118
ATP Sigma A2383
Axygen Sealing Film Corning PCR-SP
CMP Sigma C1006
Coenzyme A Sigma C3144
CutSmart Buffer NEB B7204S Provided with HindIII
Cysteine Formedium DOC0122
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4004 Used for purifying DNA
dNTPs NEB N0447
E. coli tRNA Sigma (Roche) 10109541001
Folinic Acid Sigma 47612
Gene Fragment IDT
Glutamic Acid Formedium DOC0134
Glutamine Formedium DOC0130
Glycine Formedium DOC0138
GMP Sigma G8377
HEPES Sigma H3375
HindIII-HF NEB R3104L
Histidine Formedium DOC0142
Isoleucine Formedium DOC0150
Leucine Formedium DOC0154
Lysine Formedium DOC0158
Magnesium glutamate Sigma 49605
Methionine Formedium DOC0166
Microtiter Plate (384 well) Greiner 781906
Microtiter Plate (96 well) Greiner 655809
Multimode Plate Reader BioTek Synergy Neo2
NAD Sigma N8535
NanoPhotometer Implen NP80
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480
PCR Tube VWR 20170-012
Phenylalanine Formedium DOC0170
Phosphoenolpyruvate Sigma (Roche) 10108294
Potassium glutamate Sigma G1501
Potassium oxalate Fisher Scientific P273
Proline Formedium DOC0174
Putrescine Sigma P5780
Serine Formedium DOC0178
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification Kit Cytiva 25640010 Used for RCA
Thermal Cycler Biorad C1000 Touch
Thermoblock Eppendorf ThermoMixer FP
Threonine Formedium DOC0182
Tryptophan Formedium DOC0186
Tyrosine Formedium DOC0190
UMP Sigma U6375
Valine Formedium DOC0194
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Riferimenti

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Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (172), e62728, doi:10.3791/62728 (2021).
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