מדידת ה-pH, הכימיות האדומות והיכולת המשפילה של מקרופאינוזום באמצעות מיקרוסקופיה רציומטרית דו-פלואורופור
Summary
אנו מתארים פרוטוקולים למדידת pH, אירועים חמצוניים ועיכול חלבונים במקרופינוזומים בודדים בתאים חיים. דגשושם על מיקרוסקופיה יחס פלואורופור כפולה ועל היתרונות שהיא מציעה על פני טכניקות מבוססות אוכלוסייה.
Abstract
בשנים האחרונות, תחום המקרופינוציטוזיס גדל במהירות. מקרופינוציטוזיס התפתח כמנגנון מרכזי שבאמצעותו תאי מערכת החיסון המולדים שומרים על הומאוסטזיס אורגניזם וחסינות. בו זמנית, ובניגוד לתפקידו ההומיאוסטטי, הוא יכול גם לנהוג בפתולוגיות שונות, כולל סרטן וזיהומים ויראליים. שלא כמו מצבים אחרים של אנדוציטוזיס, הכלים שפותחו לחקר ההתבגרות של מקרופאינוזום נשארים לא מפותחים. כאן הפרוטוקול מתאר כלים שפותחו לאחרונה לחקר סביבת redox בתוך הלומן של מקרופאינום מוקדמים ומבשרים. מתודולוגיות לשימוש במיקרוסקופיית פלואורסצנטיות יחסרית בהערכת ה- pH, ייצור מיני חמצן תגובתי ויכולת השפלה בתוך הלומן של מקרופאינוזומים בודדים בתאים חיים מתוארים. מדידות אברונים בודדות מציעות את היתרון של חשיפת הטרוגניות מרחבית, אשר לעתים קרובות הולך לאיבוד עם גישות מבוססות אוכלוסייה. הדגש מושם על העקרונות הבסיסיים של מיקרוסקופיה יחס פלואורופור כפולה, כולל בחירת בדיקה, מכשור, כיול ושיטות חד-תאיות לעומת שיטות מבוססות אוכלוסייה.
Introduction
מקרופינוציטוזיס מתייחס לספיגת כמויות גדולות של נוזל חוץ-תאי לאברונים ציטופלסמיים הקשורים לממברנה הנקראים מקרופאינוזומים1,2. זהו תהליך שמור מאוד המבוצע על ידי אורגניזמים חד-תאיים חיים חופשיים, כגון אמבה דיקטיוסטליום spp. 3, כמו גם אנתוזואים4 ומטאזואנים2. ברוב התאים, מקרופינוציטוזיס הוא אירוע מושרה. קשירת קולטני פני התא גורמת לבולטות של הרחבות קרום פלזמה מונחות אקטין המכונות קפלים. חלק קטן מאותם קפלים, על ידי מנגנון לא מובן, לאטום את הטיפים הדיסטליים שלהם כדי ליצור macropinosomes (אם כי מעבר להיקף נייר שיטות זה, עבור ביקורות מפורטות על המכניקה של macropinocytosis, אנא עיין בהתייחסויות1,2,5,6,7). הגירוי החוץ תאי הגורמים למקרופינוציטוזיס הוא לרוב גורם גדילה מסיס5,8. בהתאם, האירוע המקרופינוציטי מאפשר בליעה של בולוס של חומר חוץ תאי שממנו התא יכול להפיק מטבוליטים שימושיים כדי להקל על הצמיחה. למרבה הצער, מסלול זה לאספקת חומרים מזינים יכול גם לנהוג פתולוגיה. תאים סרטניים מסוימים מכילים מוטציות שגורמות למקרופינוציטוזיס מתמשך או מהווה. המסירה המתמשכת של חומרים מזינים מקלה על התפשטות בלתי מבוקרת של תאים סרטניים ונקשרה לגידולים אגרסיביים במיוחד9,10,11,12,13. באופן דומה, וירוסים יכולים לגרום מקרופינוציטוזיס כדי לקבל גישה לתאים מארחים, ובכך לנהוגפתולוגיה ויראלית 14.
מקרופינוציטוזיס מתפקד גם בשמירה על חסינות לפתוגנים. תאים חיסוניים מולדים מסוימים כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים עוסקים בדגימה מכוננת ואגרסיבית של נוזל חוץ תאי באמצעות מקרופינוציטוזיס6,15,16. מצב זה של מקרופינוציטוזיס פעיל להפליא, ותא דנדריטי יחיד יכול להסתגר בנפח של נוזל חוץ תאי השווה למשקל שלו כל שעה17. למרות הדגימה המכוננת הזו, מקרופאגים ותאים דנדריטיים אינם משתכפלים ללא שליטה כמו גם תאים סרטניים, במקום זאת, נראה שהם מעבדים את החומר החוץ תאי באופן שניתן לחלץ מידע כדי ליידע על נוכחות, או אכן היעדר, של איומים פוטנציאליים. מידע מופק כמו i) דפוסים מולקולריים הקשורים פתוגן שניתן לקרוא על ידי קולטני זיהוי פתוגן תאיים ii) קטעים קצרים של חומצות אמינו שניתן לטעון על מולקולות היסטו-תאימות גדולות להקרנה על ידי תאים של מערכת החיסון אדפטיבית16,18,19. לא ברור אם פתוגנים חתרים תחת מסלול זה לעיבוד מידע על ידי תאי מערכת החיסון.
למרות תפקידים מוגדרים היטב וביקורתיים אלה עבור macropinocytosis הן בשמירה על חסינות הומאוסטזיס ובניגוד למצבים אחרים הנחקרים יותר של אנדוציטוזיס, מעט מהעבודה הפנימית (הזוהרת) של מקרופאינוזומים ידועה. פיתוח פרוטוקולים וכלים סטנדרטיים לחקר הביוכימיה הזוהרת של מקרופאינוזומים לא רק יעזור לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה הייחודית שלהם, אלא יספק תובנה שניתן למנף לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות, כולל אספקת תרופות20. שיטה זו תתמקד בכלים שפותחו לאחרונה לנתח, ברמת האברונים הבודדים, היבטים שונים של הביוכימיה הזוהרת של מקרופאינום.
פלואורופורים יכולים לשמש למדידת ביוכימיה ספציפית של אברונים אם i) הם מחולקים באופן מועדף לתוך תא העניין ו /או ii) הם עוברים שינויים ספקטרליים בתגובה לפרמטר העניין. לדוגמה, במקרה של pH, בסיסים חלשים פלואורסצנטיים, כגון כתום אקרידן, סגול סהר, וצבעי LysoTracker מצטברים באופן מועדף אברונים חומציים. לכן, העוצמה היחסית שלהם היא אינדיקציה גסה כי אברון שכותרתו חומצית. פלואורופורים אחרים בעלי תגובה ל-pH, כגון פלואורסצין, pHrodo ו-cypHer5e, עוברים שינויים ספקטרליים עם קשירה לפרוטונים(איור 1A–C). שינויים בפליטת הפלואורסצנטיות של פלואורופורים רגישים ל- pH יכולים אפוא לספק קירוב שימושי של pH. השימוש בפלואורופור יחיד, לעומת זאת, מציג מספר חסרונות. לדוגמה, שינויים במישור המוקד, ההלבנה והשינויים בנפח של אברונים בודדים, תופעה שכיחה במקרופינוזומים21, יכולים לגרום לשינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של פלואורופור יחיד, ולא ניתן לתקן זאת בקלות עבור22. הערכות אורך גל יחיד, אם כי שימושי להדמיה תאים חומציים, ולכן הם איכותיים לחלוטין.
גישה כמותית יותר היא למקד את הפלורופור הרגיש לפרמטר יחד עם פלואורופור התייחסות לאברון העניין. פלואורופור הייחוס הוא באופן אידיאלי חסר רגישות לשינויים ביוכימיים בתוך האברונים (איור 1D–F) ולכן ניתן להשתמש בו כדי לתקן שינויים במישור המוקד, נפח organellar, ובמידה מסוימת, צילום23. באמצעות גישה זו, המכונה פלואורסצנטיות יחסית פלואורופור כפולה, ניתן להשיג תיקון על ידי יצירת יחס של פליטת פלואורסצנטיות של פלואורופור רגיש לפרמטרים לפלואורופור הייחוס.
כאן, הפרוטוקול יהיה ניצול העיקרון של הדמיה יחס פלואורופור כפול כדי למדוד pH, אירועים חמצוניים, השפלת חלבון בתוך מקרופאינוזומים. בכל מקרה, פלואורופור ייבחר כי הוא רגיש לפרמטר של עניין פלואורופור התייחסות. על מנת למקד את הפלורופורים במיוחד למקרופאינוזומים, הם יהיו יחד בשיתוף עם 70 kDa dextran, אשר משולב באופן מועדף מקרופאינוזומים24. כל ההסתה תבוצע בתאי Raw264.7 אך ניתן להתאיםן לסוגי תאים אחרים. במידת האפשר, יחסי הפלואורסצנטיות כוילו כנגד עקומת ייחוס כדי להשיג ערכים מוחלטים. חשוב לציין, כל המדידות יבוצעו בתאים חיים להערכה דינמית וכמותית של הסביבה הזוהרת של מקרופאינום.
בעת בחירת פלואורופורים רגישים ל- pH, יש לשקול מספר שיקולים. הראשון הוא pKa של הפלורופור, אשר מציין את הטווח של ערכי pH שבו הבדיקה תהיה רגישה ביותר. אם ההנחה היא כי זמן קצר לאחר היווצרות, ה- pH של macropinosome יהיה קרוב לזה של המדיום החוץ תאי (~ pH 7.2) וכי הוא יהיה חומצי בהדרגה באמצעות אינטראקציות עם אנדוזומים מאוחרים וליזוזומים (~ pH 5.0), אז בדיקה עם pKa כי הוא רגיש בטווח זה (איור 2C) יש לבחור. פלואורופור פלואורסצ’ין, שיש לו pKa של 6.4, רגיש באופן אופטימלי בטווח זה. זה שימש בהרחבה כדי למדוד אברונים דומים אחרים, כגון phagosomes, ויהיה פלואורופור של בחירה בכתב יד זה22,25. כפלואורופור התייחסות, ייעשה שימוש בטטרםאתיל-רדואמין, דבר שאינו רגיש ל-pH (איור 1E). פלואורופורים אחרים, כגון pHrodo ו cypHer5e עשויים להיות מוחלפים פלואורסצין שבו המאפיינים הספקטרליים של פלואורסצין אכן תואמים משתנים ניסיוניים אחרים. כמה פלואורופורים התייחסות הציע עבור pHrodo ו cypHer5e מוצגים באיור 1.
שיקול שני הוא השיטה שבאמצעותה שני הפלורופורים יכוונו במיוחד למקרופאינוזום. דקסטרן בגודל 70 kDa, בעל רדיוס הידרודינמי של כ-7 ננומטר, אינו נדבק באופן לא ספציפי לתאים ומשולב במקרופינומים, אך לא בורות או מערות מצופים קלאתרין, ולכן מסמן מקרופאינומים (איור 2A ואיור 3A, B)16,24,26. בפרוטוקול זה, פלואורסציין שכותרתו 70 kDa dextran ו tetramethylrhodamine (TMR)-שכותרתו 70 kDa dextran ישמשו בדיקות רגיש pH וייחוס, בהתאמה.
בתאי מערכת החיסון המולדים, מקרופינוציטוזיס ופגוציטוזיס מייצגים את שני המסלולים העיקריים להפנמה של חומר אקסוגני לעיבוד והצגה לאחר מכן לתאים של התגובה החיסונית המסתגלת27. השליטה הקפדנית והמתואמת של הכימיה האדומה של הלומן של פאגוזומים ומקרופינוזומים היא קריטית לעיבוד ספציפי להקשר של חומר אקסוגני. אולי הרגולטור הנחקר ביותר של אירועים חמצוניים בפגוזומים הוא אוקסידאז NADPH, קומפלקס רב-תת-קרקעי גדול המייצר כמויות גדולות של מיני חמצן תגובתי (ROS) בתוך הלומן של פאגוזומים28. ואכן, פעילותה היא מרכזית לעיבוד אנטיגן מתאים בתוך phagosomes29,30. עם זאת, הפעילות של אוקסידאז NADPH על ממברנות macropinosomal לא נחקרה.
בפרוטוקול זה, אסתר הסוצ’ינימידיל H2DCFDA משמשת למדידת אירועים חמצוניים בתוך המקרופאינוזום. זוהי צורה שונה של פלואורסצ’ין (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate), שהוא פלואורסצנטי מינימלי בצורתו המופחתת. לאחר חמצון, פליטת הפלואורסצנטיות שלו עולה באופן משמעותי. עם זאת, ראוי לציין אזהרה משמעותית של H2DCFDA – כפי שהוא מבוסס על פלואורופור פלואורסצין, הפלואורסצנטיות שלו מרווה גם בתאים חומציים, ויש לנקוט זהירות כדי לשלוט על משתנה זה בעת תכנון ניסויים28. בדומה לגישה למדידת pH, אסתר הסוצ’ינימידיל H2DCFDA תוצמד באופן קוולנטי ל- 70 kDa dextran ו- Dextran עם תווית TMR 70 kDa ישמשו כפזור הייחוס (איור 3A).
אובלבומין פלואורסצנטי ישמש למדידת ירידה בחלבון בתוך מקרופאינוזומים. הסגלגל המשמש כאן מסומן בצפיפות עם 4,4-difluoro-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-indacene (BODIPY) FL כי הוא מרווה את עצמו. עם העיכול, פפטידים בצבע פלואורסצנטי חזק משוחררים. כמו אליבאמין לא ניתן להטות בקלות ל 70 kDa dextran, תאים עם TMR מסומן 70 kDa dextran ו אובלבומין שלב נוזל יהיה דגירה משותפת. אות ה-TMR ישמש ליצירת מסכת מקרופאינום במהלך ניתוח שלאחר ההדמיה, והאות המשתחרר מהסגלגל המעוכל יימדד בתוך המסכה (איור 3B).
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שיש מספר פרוטוקולים למדידות תפוקה נמוכה וגבוהה של ספיגה מקרופינוציטית במקרופסגים, פיברובלסטים ואפילו Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,נעשו מעט מאוד ניסיונות למדוד את הביוכימיה הזוהרת של תאים דינמיים א?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאוניברסיטת קלגרי על תמיכתה. ברצוננו גם להודות לד”ר רובין ייטס על הגישה לריגנטים, ציוד ודיונים שימושיים.
Materials
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | – | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
Riferimenti
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -. W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).
- Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).
