Het meten van de pH, redoxchemie en degradatieve capaciteit van macropinosomen met behulp van dual-fluorofoor ratiometrische microscopie
Summary
We beschrijven protocollen voor het meten van pH, oxidatieve gebeurtenissen en eiwitvertering in individuele macropinosomen in levende cellen. De nadruk wordt gelegd op dual-fluorofoor ratiometrische microscopie en de voordelen die het biedt ten opzichte van populatiegebaseerde technieken.
Abstract
In de afgelopen jaren is het gebied van macropinocytose snel gegroeid. Macropinocytose is naar voren gekomen als een centraal mechanisme waarmee aangeboren immuuncellen de organismale homeostase en immuniteit handhaven. Tegelijkertijd, en in tegenstelling tot zijn homeostatische rol, kan het ook verschillende pathologieën veroorzaken, waaronder kanker en virale infecties. In tegenstelling tot andere vormen van endocytose, blijven de instrumenten die zijn ontwikkeld voor het bestuderen van de rijping van macropinosomen onderontwikkeld. Hier beschrijft het protocol nieuw ontwikkelde hulpmiddelen voor het bestuderen van de redoxomgeving binnen het lumen van vroege en rijpende macropinosomen. Methodologieën voor het gebruik van ratiometrische fluorescentiemicroscopie bij het beoordelen van de pH, de productie van reactieve zuurstofsoorten en de degradatieve capaciteit binnen het lumen van individuele macropinosomen in levende cellen worden beschreven. Enkelvoudige organelmetingen bieden het voordeel van het onthullen van spatiotemporale heterogeniteit, die vaak verloren gaat bij populatiegebaseerde benaderingen. De nadruk wordt gelegd op de basisprincipes van duale fluorofoor ratiometrische microscopie, waaronder sondeselectie, instrumentatie, kalibratie en eencellige versus populatiegebaseerde methoden.
Introduction
Macropinocytose verwijst naar de opname van grote hoeveelheden extracellulaire vloeistof in membraangebonden cytoplasmatische organellen genaamd macropinosomen1,2. Het is een zeer geconserveerd proces dat wordt uitgevoerd door vrijlevende eencellige organismen, zoals de amoebe Dictyostelium spp. 3, evenals anthozoën4 en metazoën2. In de meeste cellen is macropinocytose een geïnduceerde gebeurtenis. De ligatie van celoppervlakreceptoren induceert het uitsteeksel van actine-aangedreven plasmamembraanuitbreidingen die ruches worden genoemd. Een fractie van die ruches, door een slecht begrepen mechanisme, verzegelen op hun distale uiteinden om macropinosomen te vormen (hoewel buiten het bestek van dit methodedocument, voor gedetailleerde beoordelingen van de mechanica van macropinocytose, raadpleegt u referenties1,2,5,6,7). De extracellulaire stimulus die macropinocytose induceren is meestal een oplosbare groeifactor5,8. Dienovereenkomstig maakt de macropinocytische gebeurtenis de inname mogelijk van een bolus van extracellulair materiaal waaruit de cel nuttige metabolieten kan afleiden om de groei te vergemakkelijken. Helaas kan deze route voor de levering van voedingsstoffen ook de pathologie stimuleren. Bepaalde kankercellen herbergen mutaties die resulteren in continue of constitutieve macropinocytose. De continue levering van voedingsstoffen vergemakkelijkt de ongecontroleerde proliferatie van kankercellen en is in verband gebracht met bijzonder agressieve tumoren9,10,11,12,13. Evenzo kunnen virussen macropinocytose induceren om toegang te krijgen tot gastheercellen, waardoor virale pathologie wordtaansturen 14.
Macropinocytose functioneert ook bij het behoud van de immuniteit tegen pathogenen. Bepaalde aangeboren immuuncellen zoals macrofagen en dendritische cellen houden zich bezig met de constitutieve en agressieve bemonstering van extracellulaire vloeistof via macropinocytose6,15,16. Deze manier van macropinocytose is ongelooflijk actief en een enkele dendritische cel kan zichzelf elk uur ophopen met een volume extracellulaire vloeistof die gelijk is aan zijn eigen gewicht17. Ondanks deze constitutieve bemonstering repliceren macrofagen en dendritische cellen zich niet ongecontroleerd zoals tumorcellen, in plaats daarvan lijken ze het extracellulaire materiaal zodanig te verwerken dat informatie kan worden geëxtraheerd om te informeren over de aanwezigheid, of zelfs afwezigheid, van potentiële bedreigingen. Informatie wordt geëxtraheerd als i) pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen die kunnen worden gelezen door intracellulaire pathogeenherkenningsreceptoren en ii) korte stukken aminozuren die kunnen worden geladen op belangrijke histocompatibiliteitsmoleculen voor screening door cellen van het adaptieve immuunsysteem16,18,19. Of pathogenen deze route voor informatieverwerking door immuuncellen ondermijnen, is op dit moment onduidelijk.
Ondanks deze goed gedefinieerde en kritische rollen voor macropinocytose in zowel het behoud van immuniteit als homeostase en in tegenstelling tot andere meer algemeen bestudeerde vormen van endocytose, is er weinig bekend over de innerlijke (luminale) werking van macropinosomen. Het ontwikkelen van gestandaardiseerde protocollen en hulpmiddelen om de luminale biochemie van macropinosomen te bestuderen, zal ons niet alleen helpen hun unieke biologie beter te begrijpen, maar zal ook inzicht bieden dat kan worden gebruikt voor nieuwe therapeutische strategieën, waaronder medicijnafgifte20. Dit methodemanuscript zal zich richten op recent ontwikkelde hulpmiddelen om, op het niveau van één organel, verschillende aspecten van de luminale biochemie van macropinosomen te ontleden.
Fluoroforen kunnen worden gebruikt om specifieke biochemie van organellen te meten als i) ze bij voorkeur in het interessecompartiment verdelen en /of ii) ze spectrale veranderingen ondergaan als reactie op de parameter van belang. Bijvoorbeeld, in het geval van pH, fluorescerende zwakke basen, zoals acridine sinaasappel, cresypaars en de LysoTracker kleurstoffen accumuleren bij voorkeur in zure organellen. Daarom is hun relatieve intensiteit een ruwe indicatie dat het gelabelde organel zuur is. Andere pH-responsieve fluoroforen, zoals fluoresceïne, pHrodo en cypHer5e, ondergaan spectrale veranderingen bij binding aan protonen (Figuur 1A–C). Veranderingen in de fluorescentie-emissie van pH-gevoelige fluoroforen kunnen daarom een nuttige benadering van de pH opleveren. Het gebruik van enkelvoudige fluoroforen brengt echter een aantal nadelen met zich mee. Bijvoorbeeld, veranderingen in het brandpuntsvlak, fotobleaching en veranderingen in het volume van individuele organellen, een veel voorkomend verschijnsel in macropinosomen21, kunnen veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van enkele fluoroforen veroorzaken, en dit kan niet gemakkelijk worden gecorrigeerd voor22. Beoordelingen met één golflengte, hoewel nuttig voor het visualiseren van zure compartimenten, zijn daarom puur kwalitatief.
Een meer kwantitatieve benadering is om de parametergevoelige fluorofoor samen met een referentiefluoofoor naar het organel van belang te richten. De referentiefluoofoor is idealiter ongevoelig voor biochemische veranderingen in het organel (Figuur 1D–F) en kan daarom worden gebruikt om te corrigeren voor veranderingen in het brandpuntsvlak, organellaire volume en, tot op zekere hoogte, fotobleaching23. Met behulp van deze benadering, aangeduid als dual-fluorofoor ratiometrische fluorescentie, kan correctie worden bereikt door een verhouding te genereren van de fluorescentie-emissie van de parametergevoelige fluorofoor tot de referentiefluoofoor.
Hier zal het protocol het principe van dual-fluorofoor ratiometrische beeldvorming gebruiken om pH, oxidatieve gebeurtenissen en eiwitafbraak binnen macropinosomen te meten. In elk geval wordt een fluorofoor geselecteerd die gevoelig is voor de parameter van belang en een referentiefluoofoor. Om de fluoroforen specifiek op macropinosomen te richten, zullen ze covalent worden gekoppeld aan 70 kDa dextran, dat bij voorkeur wordt opgenomen in macropinosomen24. Alle testen worden uitgevoerd in Raw264.7-cellen, maar kunnen worden aangepast aan andere celtypen. Waar mogelijk worden de fluorescentieverhoudingen gekalibreerd aan de hand van een referentiecurve om absolute waarden te verkrijgen. Belangrijk is dat alle metingen zullen worden uitgevoerd in levende cellen voor dynamische en kwantitatieve beoordeling van de luminale omgeving van macropinosomen.
Bij het selecteren van pH-gevoelige fluoroforen moeten een aantal overwegingen worden afgewogen. De eerste is de pKa van de fluorofoor, die het bereik van pH-waarden aangeeft waarbij de sonde het meest gevoelig zal zijn. Als wordt aangenomen dat kort na de vorming de pH van het macropinosoom dicht bij die van het extracellulaire medium (~pH 7,2) zal liggen en dat het geleidelijk zal verzuren door interacties met late endosomen en lysosomen (~pH 5,0), dan moet een sonde met een pKa die gevoelig is binnen dat bereik (Figuur 2C) worden geselecteerd. De fluorofoorfluoesceïne, die een pKa van 6,4 heeft, is binnen dat bereik optimaal gevoelig. Het is uitgebreid gebruikt om andere soortgelijke organellen te meten, zoals fagosomen, en zal de fluorofoor van keuze zijn in dit manuscript22,25. Als referentiefluoofoor zal tetramethylrhodamine worden gebruikt, dat ongevoelig is voor pH(figuur 1E). Andere fluoroforen, zoals pHrodo en cypHer5e, kunnen worden vervangen door fluoresceïne waarbij de spectrale eigenschappen van fluoresceïne overeenkomen met andere experimentele variabelen. Enkele voorgestelde referentiefluoroforen voor pHrodo en cypHer5e zijn weergegeven in figuur 1.
Een tweede overweging is de methode waarmee de twee fluoroforen specifiek gericht zullen worden op macropinosomen. Dextran van de grootte 70 kDa, die een hydrodynamische straal van ongeveer 7 nm heeft, kleeft niet niet-specifiek aan cellen en wordt opgenomen in macropinosomen, maar niet met clathrin bedekte putten of caveolae, en markeert daarom macropinosomen (Figuur 2A en Figuur 3A, B)16,24,26. In dit protocol zullen fluoresceïne-gelabelde 70 kDa dextran en tetramethylrhodamine (TMR)-gelabelde 70 kDa dextran worden gebruikt als respectievelijk de pH-gevoelige en referentie probes.
In aangeboren immuuncellen vertegenwoordigen macropinocytose en fagocytose de twee belangrijkste routes voor de internalisatie van exogene materiaal voor verwerking en daaropvolgende presentatie aan cellen van de adaptieve immuunrespons27. De zorgvuldige en gecoördineerde controle van de redoxchemie van het lumen van fagosomen en macropinosomen is van cruciaal belang voor de contextspecifieke verwerking van exogene materie. Misschien wel de best bestudeerde regulator van oxidatieve gebeurtenissen in fagosomen is de NADPH-oxidase, een groot multi-subunitcomplex dat grote hoeveelheden reactieve zuurstofsoorten (ROS) produceert binnen het lumen van fagosomen28. De activiteit ervan staat immers centraal in de juiste antigeenverwerking binnen fagosomen29,30. Toch is de activiteit van de NADPH-oxidase op macropinosomale membranen niet onderzocht.
In dit protocol wordt de H2DCFDA-succinimidylester gebruikt voor het meten van oxidatieve gebeurtenissen in het macropinosoom. Dit is een gemodificeerde vorm van fluoresceïne (2′,7′-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat), dat minimaal fluorescerend is in zijn gereduceerde vorm. Bij oxidatie neemt de fluorescentie-emissie aanzienlijk toe. Het is echter vermeldenswaard een belangrijk voorbehoud van H2DCFDA – omdat het is gebaseerd op de fluorofoorfluoesceïne, wordt de fluorescentie ook geblust in zure compartimenten en moet ervoor worden gezorgd dat deze variabele wordt gecontroleerd bij het ontwerpen van experimenten28. Vergelijkbaar met de benadering voor het meten van de pH, zal de H2DCFDA-succinimidylester covalent worden bevestigd aan 70 kDa dextran en TMR-gelabeld 70 kDa dextran zal worden gebruikt als referentiefluoofoor (Figuur 3A).
Fluorescerend ovalbumine zal worden gebruikt om eiwitafbraak binnen macropinosomen te meten. Het hier gebruikte ovalbumine is dicht gelabeld met een 4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL-kleurstof die zelf geblust is. Bij de spijsvertering komen sterk fluorescerende kleurstof-gelabelde peptiden vrij. Omdat ovalbumine niet gemakkelijk kan worden geconjugeerd tot 70 kDa dextran, zullen cellen met TMR-gelabeld 70 kDa dextran en vloeibare fase ovalbumine worden gecoïncubeerd. Het TMR-signaal zal worden gebruikt om een macropinosoommasker te genereren tijdens post-imaging analyse, en het signaal dat vrijkomt van het verteerde ovalbumine zal worden gemeten in het masker(Figuur 3B).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel er een aantal protocollen zijn voor zowel lage als hoge doorvoermetingen van macropinocytische opname in macrofagen, fibroblasten en zelfs Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,er zijn zeer weinig pogingen gedaan om de luminale biochemie van deze dynamische compartimenten te meten. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een gebrek aan sondes die effici?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de Universiteit van Calgary voor haar steun. We willen ook Dr. Robin Yates bedanken voor de toegang tot reagentia, apparatuur en nuttige discussies.
Materials
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | – | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
Riferimenti
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -. W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).
- Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).
