Mesure du pH, de la chimie redox et de la capacité dégradative des macropinosomes à l’aide de la microscopie ratiométrique à double fluorophore
Summary
Nous décrivons des protocoles pour mesurer le pH, les événements oxydatifs et la digestion des protéines dans les macropinosomes individuels dans les cellules vivantes. L’accent est mis sur la microscopie ratiométrique à double fluorophore et les avantages qu’elle offre par rapport aux techniques basées sur la population.
Abstract
Ces dernières années, le domaine de la macropinocytose s’est développé rapidement. La macropinocytose est apparue comme un mécanisme central par lequel les cellules immunitaires innées maintiennent l’homéostasie et l’immunité de l’organisme. Simultanément, et contrairement à son rôle homéostatique, il peut également conduire à diverses pathologies, y compris le cancer et les infections virales. Contrairement à d’autres modes d’endocytose, les outils développés pour étudier la maturation des macropinosomes restent sous-développés. Ici, le protocole décrit des outils nouvellement développés pour étudier l’environnement redox dans la lumière des macropinosomes précoces et en cours de maturation. Les méthodologies d’utilisation de la microscopie à fluorescence ratiométrique pour évaluer le pH, la production d’espèces réactives de l’oxygène et la capacité de dégradation dans la lumière des macropinosomes individuels dans les cellules vivantes sont décrites. Les mesures d’organites uniques offrent l’avantage de révéler l’hétérogénéité spatio-temporelle, qui est souvent perdue avec les approches basées sur la population. L’accent est mis sur les principes de base de la microscopie ratiométrique à double fluorophore, y compris la sélection des sondes, l’instrumentation, l’étalonnage et les méthodes unicellulaires par rapport aux méthodes basées sur la population.
Introduction
La macropinocytose fait référence à l’absorption de grandes quantités de liquide extracellulaire dans des organites cytoplasmiques liés à la membrane appelés macropinosomes1,2. C’est un processus hautement conservé effectué par des organismes unicellulaires libres, tels que l’amibe Dictyostelium spp. 3, ainsi que les anthozoaires4 et les métazoaires2. Dans la plupart des cellules, la macropinocytose est un événement induit. La ligature des récepteurs de la surface cellulaire induit la saillie d’extensions de membrane plasmique entraînées par l’actine appelées volants. Une fraction de ces volants, par un mécanisme mal compris, scellent à leurs extrémités distales pour former des macropinosomes (bien qu’au-delà de la portée de cet article sur les méthodes, pour des examens détaillés sur la mécanique de la macropinocytose, veuillez vous référer aux références1,2,5,6,7). Le stimulus extracellulaire induisant la macropinocytose est le plus souvent un facteur de croissance soluble5,8. En conséquence, l’événement macropinocytaire permet l’ingestion d’un bolus de matériel extracellulaire à partir duquel la cellule peut dériver des métabolites utiles pour faciliter la croissance. Malheureusement, cette voie d’administration de nutriments peut également entraîner une pathologie. Certaines cellules cancéreuses hébergent des mutations qui entraînent une macropinocytose continue ou constitutive. L’apport continu de nutriments facilite la prolifération incontrôlée des cellules cancéreuses et a été lié à des tumeurs particulièrement agressives9,10,11,12,13. De même, les virus peuvent induire une macropinocytose pour accéder aux cellules hôtes, entraînant ainsi une pathologie virale14.
La macropinocytose fonctionne également dans le maintien de l’immunité aux agents pathogènes. Certaines cellules immunitaires innées telles que les macrophages et les cellules dendritiques s’engagent dans l’échantillonnage constitutif et agressif du liquide extracellulaire via la macropinocytose6,15,16. Ce mode de macropinocytose est incroyablement actif, et une seule cellule dendritique peut s’engorger d’un volume de liquide extracellulaire équivalent à son propre poids toutes les heures17. Malgré cet échantillonnage constitutif, les macrophages et les cellules dendritiques ne se répliquent pas de manière incontrôlable comme le font les cellules tumorales, mais semblent plutôt traiter le matériel extracellulaire de manière à ce que l’information puisse être extraite pour informer de la présence, voire de l’absence, de menaces potentielles. L’information est extraite comme i) des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes qui peuvent être lus par les récepteurs de reconnaissance intracellulaire des agents pathogènes et ii) de courtes étendues d’acides aminés qui peuvent être chargées sur les principales molécules d’histocompatibilité pour le dépistage par les cellules du système immunitaire adaptatif16,18,19. Il n’est pas clair à l’heure actuelle si les agents pathogènes subvertissent cette voie pour le traitement de l’information par les cellules immunitaires.
Malgré ces rôles bien définis et critiques de la macropinocytose à la fois dans le maintien de l’immunité et de l’homéostasie et contrairement à d’autres modes d’endocytose plus couramment étudiés, peu de fonctionnement interne (luminal) des macropinosomes sont connus. Le développement de protocoles et d’outils standardisés pour étudier la biochimie luminale des macropinosomes nous aidera non seulement à mieux comprendre leur biologie unique, mais fournira également des informations qui peuvent être exploitées pour de nouvelles stratégies thérapeutiques, y compris l’administration de médicaments20. Ce manuscrit de méthode se concentrera sur des outils récemment développés pour disséquer, au niveau de l’organite unique, divers aspects de la biochimie luminale des macropinosomes.
Les fluorophores peuvent être utilisés pour mesurer des biochimies spécifiques d’organites si i) ils se divisent préférentiellement dans le compartiment d’intérêt et/ou ii) s’ils subissent des changements spectraux en réponse au paramètre d’intérêt. Par exemple, dans le cas du pH, les bases faibles fluorescentes, telles que l’orange acridine, le violet crésylique et les colorants LysoTracker, s’accumulent préférentiellement dans les organites acides. Par conséquent, leur intensité relative est une indication approximative que l’organite marqué est acide. D’autres fluorophores sensibles au pH, tels que la fluorescéine, le pHrodo et le cypHer5e, subissent des changements spectraux lors de la liaison aux protons(Figure 1A–C). Les modifications de l’émission de fluorescence des fluorophores sensibles au pH peuvent donc fournir une approximation utile du pH. L’utilisation de fluorophores simples présente toutefois un certain nombre d’inconvénients. Par exemple, les modifications du plan focal, le photobleachage et les modifications du volume des organites individuels, un phénomène courant dans les macropinosomes21,peuvent induire des modifications de l’intensité de fluorescence des fluorophores simples, ce qui ne peut pas être facilement corrigé pour22. Les évaluations à longueur d’onde unique, bien qu’utiles pour visualiser les compartiments acides, sont donc purement qualitatives.
Une approche plus quantitative consiste à cibler le fluorophore sensible aux paramètres avec un fluorophore de référence à l’organite d’intérêt. Le fluorophore de référence est idéalement insensible aux changements biochimiques au sein de l’organite(Figure 1D–F)et peut donc être utilisé pour corriger les changements dans le plan focal, le volume organellaire et, dans une certaine mesure, le photobleachage23. En utilisant cette approche, appelée fluorescence ratiométrique à double fluorophore, la correction peut être obtenue en générant un rapport entre l’émission de fluorescence du fluorophore sensible aux paramètres et le fluorophore de référence.
Ici, le protocole utilisera le principe de l’imagerie ratiométrique à double fluorophore pour mesurer le pH, les événements oxydatifs et la dégradation des protéines dans les macropoinosomes. Dans chaque cas, un fluorophore sensible au paramètre d’intérêt sera sélectionné et un fluorophore de référence. Afin de cibler les fluorophores spécifiquement sur les macropinosomes, ils seront couplés de manière covalente à 70 kDa dextran, qui est préférentiellement incorporé dans les macropinosomes24. Tous les tests seront effectués dans des cellules Raw264.7 mais peuvent être adaptés à d’autres types de cellules. Dans la mesure du possible, les rapports de fluorescence seront étalonnés par rapport à une courbe de référence pour obtenir des valeurs absolues. Il est important de savoir que toutes les mesures seront effectuées dans des cellules vivantes pour une évaluation dynamique et quantitative de l’environnement luminal des macropinosomes.
Lors de la sélection de fluorophores sensibles au pH, un certain nombre de considérations doivent être pesées. Le premier est le pKa du fluorophore, qui indique la plage de valeurs de pH à laquelle la sonde sera la plus sensible. Si l’on suppose que peu de temps après la formation, le pH du macropinosome sera proche de celui du milieu extracellulaire (~pH 7,2) et qu’il s’acidifiera progressivement par des interactions avec les endosomes et les lysosomes tardifs (~pH 5,0), alors une sonde avec un pKa sensible dans cette plage(Figure 2C)doit être sélectionnée. La fluorescéine fluorophore, qui a un pKa de 6,4, est extrêmement sensible dans cette plage. Il a été largement utilisé pour mesurer d’autres organites similaires, tels que les phagosomes, et sera le fluorophore de choix dans ce manuscrit22,25. Comme fluorophore de référence, on utilisera de la tétraméthylrhodamine, qui est insensible au pH(figure 1E). D’autres fluorophores, tels que pHrodo et cypHer5e, peuvent être substitués à la fluorescéine lorsque les propriétés spectrales de la fluorescéine correspondent à d’autres variables expérimentales. Certains fluorophores de référence suggérés pour pHrodo et cypHer5e sont illustrés à la figure 1.
Une deuxième considération est la méthode par laquelle les deux fluorophores seront ciblés spécifiquement sur les macropinosomes. Le dextran de la taille 70 kDa, qui a un rayon hydrodynamique d’environ 7 nm, ne colle pas non spécifiquement aux cellules et est incorporé dans les macropinosomes, mais pas dans les fosses revêtues de clathrine ou les caveolae, et marque donc les macropinosomes (Figure 2A et Figure 3A, B)16,24,26. Dans ce protocole, le dextran de 70 kDa marqué à la fluorescéine et le dextran de 70 kDa marqué à la tétraméthylrhodamine (TMR) seront utilisés comme sondes sensibles au pH et de référence, respectivement.
Dans les cellules immunitaires innées, la macropinocytose et la phagocytose représentent les deux principales voies d’internalisation du matériel exogène pour le traitement et la présentation ultérieure aux cellules de la réponse immunitaire adaptative27. Le contrôle minutieux et coordonné de la chimie redox de la lumière des phagosomes et des macropoinosomes est essentiel au traitement spécifique au contexte du matériau exogène. Le régulateur d’événements oxydatifs dans les phagosomes est peut-être le NADPH oxydase, un grand complexe multi-sous-unités qui produit de grandes quantités d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la lumière des phagosomes28. En effet, son activité est centrale pour un traitement approprié de l’antigène au sein des phagosomes29,30. Pourtant, l’activité de la NADPH oxydase sur les membranes macropinosomales n’a pas été explorée.
Dans ce protocole, l’ester de succinimidyle H2DCFDA est utilisé pour mesurer les événements oxydatifs au sein du macropinosome. Il s’agit d’une forme modifiée de fluorescéine (diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine), qui est peu fluorescente sous sa forme réduite. Lors de l’oxydation, son émission de fluorescence augmente considérablement. Il convient toutefois de noter une mise en garde importante de H2DCFDA – comme il est basé sur la fluorescéine fluorophore, sa fluorescence est également trempée dans des compartiments acides, et il faut prendre soin de contrôler cette variable lors de la conception des expériences28. Semblable à l’approche de mesure du pH, l’ester de succinimidyle H2DCFDA sera attaché de manière covalente à 70 kDa dextran et le dextran de 70 kDa marqué TMR sera utilisé comme fluorophore de référence(Figure 3A).
L’ovalbumine fluorescente sera utilisée pour mesurer la dégradation des protéines dans les macropinosomes. L’ovalbumine utilisée ici est densément étiquetée avec un colorant FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) qui est auto-trempé. Lors de la digestion, des peptides fortement fluorescents marqués par un colorant sont libérés. Comme l’ovalbumine ne peut pas être facilement conjuguée à 70 kDa dextran, les cellules avec 70 kDa dextran marqué TMR et ovalbumine en phase fluide seront co-incubées. Le signal TMR sera utilisé pour générer un masque de macropoinosomes lors de l’analyse post-imagerie, et le signal libéré de l’ovalbumine digérée sera mesuré à l’intérieur du masque(Figure 3B).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien qu’il existe un certain nombre de protocoles pour les mesures à faible et à haut débit de l’absorption macropinocytaire dans les macrophages, les fibroblastes et même Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, très peu de tentatives ont été faites pour mesurer la biochimie luminale de ces compartiments dynamiques. Cela est probablement dû à un…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’Université de Calgary pour son soutien. Nous tenons également à remercier le Dr Robin Yates pour son accès aux réactifs, à l’équipement et aux discussions utiles.
Materials
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | – | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
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