Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen
Summary
Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate zu beschreiben, indem Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung des gesamten Sinusknotengewebes verwendet wird, um Schrittmacherfehler bei Mäusen zu identifizieren. Pharmakologische Wirkstoffe können auch in diese Methode eingeführt werden, um ihre Auswirkungen auf die intrinsische Schrittmacherei zu untersuchen.
Abstract
Der Sinusknoten (SAN), der sich im rechten Vorhof befindet, enthält die Herzschrittmacherzellen des Herzens, und eine Dysfunktion dieser Region kann Tachykardie oder Bradykardie verursachen. Die zuverlässige Identifizierung von Herzschrittmacherfehlern erfordert die Messung der intrinsischen Herzfrequenz, indem der Einfluss des autonomen Nervensystems, der Ratendefizite maskieren kann, weitgehend verhindert wird. Traditionelle Methoden zur Analyse der intrinsischen Herzschrittmacherfunktion umfassen eine medikamenteninduzierte autonome Blockade zur Messung der In-vivo-Herzfrequenz, isolierte Herzaufzeichnungen zur Messung der intrinsischen Herzfrequenz und sinoatriale Streifen- oder Einzelzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von sinoatrialen Schrittmacherzellen zur Messung spontaner Aktionspotenzial-Feuerraten. Diese traditionelleren Techniken können jedoch technisch anspruchsvoll und schwierig durchzuführen sein. Hier stellen wir eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate vor, indem wir Mikroelektrodenarray-Aufnahmen (MEA) von Sinusknotenpräparaten von Mäusen durchführen. MEAs bestehen aus mehreren Mikroelektroden, die in einem gitterartigen Muster angeordnet sind, um extrazelluläre In-vitro-Feldpotentiale aufzuzeichnen. Die hier beschriebene Methode hat den kombinierten Vorteil, dass sie relativ schneller, einfacher und präziser ist als frühere Ansätze zur Aufzeichnung intrinsischer Herzfrequenzen und gleichzeitig eine einfache pharmakologische Abfrage ermöglicht.
Introduction
Das Herz ist ein komplexes Organ, das sowohl von kardiale-intrinsischen als auch von extrinsischen Einflüssen gesteuert wird, wie sie im Gehirn entstehen. Der Sinusknoten (SAN) ist eine definierte Region im Herzen, die die Schrittmacherzellen (auch als Sinuszellen oder SA-Zellen bezeichnet) beherbergt, die für die Initiierung und Aufrechterhaltung des Herzschlags von Säugetieren verantwortlich sind1,2. Die intrinsische Herzfrequenz ist die Rate, die von den Herzschrittmacherzellen ohne Einfluss anderer kardialer oder neurohumoraler Einflüsse angetrieben wird, aber traditionelle Messungen der Herzfrequenz bei Menschen und lebenden Tieren, wie Elektrokardiogramme, spiegeln sowohl den Herzschrittmacher als auch neuronale Einflüsse auf das Herz wider. Der bemerkenswerteste neuronale Einfluss auf SA-Zellen kommt vom autonomen Nervensystem, das ständig Feuermuster moduliert, um die physiologischen Anforderungen des Körpers zu erfüllen3. Um diese Idee zu unterstützen, finden sich in der Nähe des SAN4sowohl sympathische als auch parasympathische Projektionen. Das intrinsische Herznervensystem (ICNS) ist ein weiterer wichtiger neuronaler Einfluss, bei dem ganglionierte Plexi, insbesondere in den rechten Vorhöfen, die Aktivität des SAN 5innervierenund regulieren5,6.
Das Verständnis von Schrittmacherdefiziten ist klinisch wichtig, da Funktionsstörungen vielen Herzerkrankungen zugrunde liegen und zum Risiko anderer Komplikationen beitragen können. Sick-Sinus-Syndrom (SSS) ist eine Kategorie von Krankheiten, die durch eine Dysfunktion des Sinusknotens gekennzeichnet sind, die die richtige Schrittmacherei behindert7,8. SSS kann mit Sinusbradykardie, Sinuspausen, Sinusstillstand, sinoatrialem Austrittsblock und abwechselnden Bradyarrythmien und Tachyarrhythmien9 auftreten und kann zu Komplikationen führen, einschließlich eines erhöhten Risikos für embolischen Schlaganfall und plötzlichen Tod8,10. Diejenigen mit Brugada-Syndrom, einer Herzerkrankung, die durch Kammerflimmern mit einem erhöhten Risiko für plötzlichen Herztod gekennzeichnet ist, haben ein höheres Risiko für arrhythmogene Ereignisse, wenn sie auch eine komorbide SAN-Dysfunktion haben11,12. Sinoatriale Dysfunktion kann auch physiologische Folgen über das Herz hinaus haben. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass SSS Beifällen bei einem Patienten aufgrund einer zerebralen Hypoperfusion ausgelöst wird13.
Um sinoatriale Schrittmacherdefizite zu identifizieren, müssen die intrinsischen Herzfrequenzen durch Messung der Aktivität des SAN ohne den Einfluss des autonomen Nervensystems oder humoraler Faktoren bestimmt werden. Klinisch kann dies durch pharmakologische autonome Blockade14angenähert werden, aber dieselbe Technik kann auch in Säugetiermodellen angewendet werden, um die intrinsische Herzfunktion15,16zu untersuchen. Während dieser Ansatz einen großen Teil der beitragenden neuronalen Einflüsse blockiert und eine In-vivo-Herzuntersuchung ermöglicht, beseitigt er nicht alle extrinsischen Einflüsse auf das Herz vollständig. Eine weitere Forschungstechnik, die zur Untersuchung der intrinsischen Herzfunktion in Tiermodellen verwendet wird, sind isolierte Herzaufnahmen mit Langendorff-perfundierten Herzen, die typischerweise Messungen mit Elektrogrammen, Pacing oder epikarden Multielektrodenarrays17,18,19,20beinhalten . Während diese Technik spezifischer für die Herzfunktion ist, da sie das Herz aus dem Körper entfernt, können die Messungen immer noch durch mechanoelektrische Autoregulationsmechanismen beeinflusst werden, die die intrinsischen Herzfrequenzmessungen beeinflussen könnten21. Die isolierten Herzaufnahmen können auch noch durch autonome Regulation durch das ICNS 5,6,22,23beeinflusst werden. Darüber hinaus kann die Aufrechterhaltung einer physiologisch relevanten Temperatur des Herzens, die für Herzfunktionsmessungen entscheidend ist, bei isolierten Herzansätzen schwierig sein20. Eine direktere Methode zur Untersuchung der SAN-Funktion besteht darin, SAN-Gewebe spezifisch zu isolieren und seine Aktivität zu messen. Dies kann durch SAN-Streifen (isoliertes SAN-Gewebe) oder isolierte SAN-Schrittmacherzellen24,25erreicht werden. Beide erfordern ein hohes Maß an technischer Ausbildung, da das SAN eine sehr kleine und hoch definierte Region ist und die Zellisolierung eine noch größere Herausforderung darstellt, da die Dissoziation die allgemeine Gesundheit der Zelle schädigen kann, wenn sie nicht richtig durchgeführt wird. Darüber hinaus erfordern diese Techniken elektrophysiologische Fachkenntnisse, um mit einzelnen Aufzeichnungsmikroelektroden erfolgreich aus dem Gewebe oder den Zellen aufzunehmen.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Technik zur Aufzeichnung des SAN in vitro mit einem Mikroelektrodenarray (MEA), um intrinsische Herzfrequenzmessungen zu erhalten. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass hochspezifische elektrophysiologische Aufzeichnungen forschern zugänglich gemacht werden, denen es an intensiven elektrophysiologischen Fähigkeiten mangelt. MEAs wurden zuvor verwendet, um die Kardiomyozytenfunktion in primären Kardiomyozytenkulturen26,27,28,29,30,31,32, Herzblättern33,34,35,36,37,38,39und Gewebe ganzen Mounts40zuuntersuchen. 41,42,43,44,45,46,47. Frühere Arbeiten wurden auch durchgeführt, um Feldpotentiale in SAN-Gewebe41,42zu untersuchen. Hier bieten wir eine Methodik zur Verwendung der MEA zur Aufzeichnung und Analyse der intrinsischen SAN-Feuerraten von Murinen. Wir beschreiben auch, wie diese Technik verwendet werden kann, um pharmakologische Wirkungen von Medikamenten auf die intrinsischen Zündraten von SAN zu testen, indem ein Beispielexperiment zur Verfügung gestellt wird, das die Auswirkungen von 4-Aminopyridin (4-AP), einem spannungsgesteuerten K+ Kanalblocker, zeigt. Mithilfe definierter anatomischer Landmarken können wir das SAN genau erfassen, ohne die umfangreichen Gewebedissektionen oder Zellisolierungen durchführen zu müssen, die für andere Methoden erforderlich sind. Während die MEA unerschwinglich sein kann, bieten die Aufzeichnungen hochspezifische und zuverlässige Messungen der Schrittmacherei, die in einer Vielzahl von klinischen und physiologischen Forschungsanwendungen verwendet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Üben und Beherrschen des SAN-Dissektionsprozesses ist unerlässlich, da das Gewebe zerbrechlich ist und gesundes Gewebe für eine erfolgreiche Aufnahme notwendig ist. Während der SAN-Dissektion ist eine korrekte Orientierung unerlässlich, um die richtige Geweberegion zu erhalten. Die ursprüngliche Ausrichtung des Herzens kann jedoch während des Dissektionsprozesses leicht verloren gehen, was dieses Unterfangen erschwert. Um die richtige Links-Rechts-Ausrichtung zu gewährleisten, sollten die Vorhöfe daher visue…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health mit den Fördernummern R01NS100954 und R01NS099188 finanziert.
Materials
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
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