Fremstilling af Naringenin-opløsning til in vivo-applikation
Summary
Her præsenterer protokollen fremstillingen af naringeninopløsning til in vivo intraperitoneal administration. Naringenin er fuldt opløst i en blanding af dimethylsulfoxid, Tween 80 og saltvand. De antidiabetika osteoporotiske virkninger af naringenin blev vurderet ved blodglukosetest, tartratresistent syrefosfatasefarvning og enzymbundet immunosorbentassay.
Abstract
Fremstillingen af en sammensat (fytokemisk) opløsning er et overset, men kritisk trin forud for dets anvendelse i undersøgelser såsom lægemiddelscreening. Den fuldstændige opløselighed af forbindelsen er nødvendig for sikker anvendelse og relativt stabile resultater. Her demonstreres en protokol til fremstilling af naringeninopløsning og dens intraperitoneale administration i en fedtfattig diæt og streptozotocin (STZ) -induceret diabetisk model som et eksempel. En lille mængde naringenin (3,52-6,69 mg) blev anvendt til at teste dets opløselighed i opløsningsmidler, herunder henholdsvis ethanol, dimethylsulfoxid (DMSO) og DMSO plus Tween 80 rekonstitueret i fysiologisk saltvand (PS). Fuldstændig opløselighed af forbindelsen bestemmes ved at observere opløsningens farve, tilstedeværelsen af bundfald efter centrifugering (2000 x g i 30 s) eller lade opløsningen stå i 2 timer ved stuetemperatur (RT). Efter opnåelse af en stabil forbindelse/fytokemisk opløsning kan den endelige koncentration/mængde af forbindelsen, der kræves til in vivo-undersøgelser , fremstilles i en opløsningsmiddel-only (ingen PS) stamopløsning og derefter fortyndes/blandes med PS efter ønske. De antidiabetiske osteoporotiske virkninger af naringenin hos mus (intraperitoneal administration ved 20 mg/kg legemsvægt, 2 mg/ml) blev vurderet ved måling af blodsukker, knoglemasse (mikro-CT) og knogleresorptionshastighed (TRAP-farvning og ELISA). Forskere, der leder efter detaljerede organiske / fytokemiske opløsningspræparater, vil drage fordel af denne teknik.
Introduction
Med stigende undersøgelser vedrørende brugen af fytokemiske forbindelser til lægemiddelscreening er tilgange til fremstilling af fytokemiske løsninger til evaluering af deres optimale virkninger værd at være opmærksomme på. Mange aspekter såsom opløsningsmetoden, dosering og koncentration skal overvejes ved fremstilling af forbindelsen1.
Opløsningsmiddelbaseret opløsning anvendes i vid udstrækning til fremstilling af organiske forbindelser1. De almindeligt anvendte opløsningsmidler omfatter vand, olie, dimethylsulfoxid (DMSO), methanol, ethanol, myresyre, Tween, glycerin osv.2. Selvom en suspension med uopløste stoffer er acceptabel, når forbindelsen administreres ved gastrisk sonde, er et fuldt opløst opløst stof kritisk for intravenøs administration. Da olieopløsning, suspension og emulsion kan forårsage kapillærembolier, foreslås en vandig opløsning til sammensat præparation, især ved administration af intravenøse, intramuskulære og intraperitoneale injektioner3.
Det effektive dosisområde varierer mellem forbindelser og endda blandt sygdomme behandlet med samme forbindelse. Bestemmelse af den effektive og den sikre dosis og koncentrationen afhænger af litteratur og indledende forsøg4. Her demonstreres fremstillingen af forbindelsen naringenin som et eksempel.
Naringenin (4,5,7-trihydroxy-flavanon), en polyfenolisk forbindelse, er blevet undersøgt i sygdomsbehandling for dets hepatoprotektive5, antidiabetika6, antiinflammatoriske7 og antioxidantaktiviteter8. Til in vivo-applikationer anvendes oral administration af naringenin almindeligvis. Tidligere undersøgelser rapporterede fremstilling af naringeninopløsning i 0,5% -1% carboxymethylcellulose, 0,5% methylcellulosedosis, 0,01% DMSO og fysiologisk saltvand (PS) ved 50-100 mg / kg, administreret ved oral sonde 9,10,11,12. Desuden har andre undersøgelser rapporteret at supplere naringenin med chow ved 3% (wt / wt) til oral indtagelse i en dosis på 3,6 g / kg / d13,14. Undersøgelser har også rapporteret ved hjælp af ethanol (0,5% v / v), PS og DMSO til opløsning af naringenin til intraperitoneal injektion ved 10-50 mg / kg15,16,17,18. I en undersøgelse af temporal lobe epilepsi modtog mus en injektion af naringenin suspenderet i 0,25% carboxymethylcellulose opløst i PS19. Selvom disse undersøgelser rapporterer brugen af forskellige opløsningsmidler til fremstilling af naringeninopløsninger, er der ikke rapporteret yderligere detaljer, såsom opløsningsstatus og dyrerespons.
Denne protokol indfører en procedure til fremstilling af naringeninopløsning til in vivo-anvendelse i diabetisk induceret osteoporose. Fremstillingen af injektionsopløsningen inkluderer fremstilling af opløsningsmidler og forbindelser, doseringsestimering, opløsningsproces og filtrering. Doseringen blev bestemt ud fra litteraturforskning og foreløbige eksperimenter ved at overvåge mus efter administration af injektioner hver dag i 3 dage og ændre doseringen i henhold til museadfærd. Den endelige valgte koncentration (20 mg/kg legemsvægt) blev administreret intraperitonealt 5 dage om ugen i 8 uger i en fedtrig diæt og streptozotocin (STZ)-inducerede diabetiske mus20,21. Virkningerne af naringenin i diabetisk osteoporose blev evalueret ved blodglukosetest, mikro-CT, tartratresistent syrephosphatase (TRAP) farvning og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA).
Samlet set blev det observeret, at naringenin i et koncentrationsinterval på 40-400 mg/ml ikke opløses fuldstændigt i hverken ethanol eller DMSO eller 5% (ethanol eller DMSO) plus 95% PS (v/v). Naringenin opløstes imidlertid fuldstændigt i en blanding af 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 og 92,96% PS. Den detaljerede procedure vil hjælpe forskere med at forberede forbindelsen som en injektionsopløsning til in vivo-anvendelse .
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremstillingen af fytokemisk opløsning er grundlaget for dens anvendelse in vivo. I denne protokol blev fremstillingen af naringeninopløsning demonstreret ved anvendelse af forskellige opløsningsmidler, såsom ethanol, DMSO, Tween 80 og 0,9% PS. Opløsningen i fuldstændig opløst tilstand skal overvåges yderligere ved at lade den forblive ved stuetemperatur i nogle længere timer og derefter filtreres, før den bruges in vivo.
Bestemmelse af opløsningsmiddel er et kriti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81973607 og 81573992).
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
Riferimenti
- Stoye, D. Solvents. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat’s brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
- van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single–and repeated–dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
