استخراج F420 عامل مساعد لتحليل طول ذيل Polyglutamate من الثقافات النقية الميثانوجينية والعينات البيئية
Summary
تم تحسين طريقة لاستخراج F420 عامل مساعد من الثقافات النقية لفصل الكروماتوغرافي السائل وتحليل طول ذيل F420 في عينات الثقافة البحتة والبيئة.
Abstract
يلعب العامل المساعد F420 دورا مركزيا كحامل هيدريد في عملية التمثيل الغذائي الأولي والثانوي للعديد من الأمراض البكتيرية والأركيولوجية. يشتهر المتبرع المساعد بدوره في تكوين الميثانوجينيز ، حيث يسهل ردود الفعل الصعبة ديناميكيا حراريا. وبما أن ذيل البولي غلوتامات يختلف في الطول بين الكائنات الحية المختلفة، فإن تحليلات الملف الشخصي للطول قد تكون أداة قوية لتمييز وتميز مختلف المجموعات والمسارات في مختلف الموائل. هنا، يصف البروتوكول استخراج وتحسين الكشف عن F420 العامل المساعد من خلال تطبيق استخراج المرحلة الصلبة جنبا إلى جنب مع تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء مستقلة عن النهج البيولوجية الثقافية أو الجزيئية. تم تطبيق هذه الطريقة للحصول على معلومات إضافية حول التعبير عن F420 العامل المساعد من المجتمعات الميكروبية في التربة والحمأة اللاهوائية والثقافات النقية وتم تقييمها من خلال تجارب التصاعد. وبالتالي، نجحت الدراسة في توليد ملامح مختلفة F420 الذيل طول لmhanogens هيدروجينية وacetoclastic في الثقافات النقية الميثانوجينية الخاضعة للرقابة، وكذلك من العينات البيئية مثل حمأة هاضم اللاهوائية والتربة.
Introduction
F420 هو عامل مساعد واسع الانتشار ولكنه مهمل في كثير من الأحيان ، والذي يعمل كحامل هيدريد إلكترونين ملزم في عمليات التمثيل الغذائي الأولية والثانوية لكل من Archaea و Bacteria1،2. F420 هو 5-deazaflavin ويشبه هيكليا فلافينس، حيث خصائصه الكيميائية والبيولوجية هي أكثر قابلية للمقارنة مع تلك التي NAD + أو NADP +. بسبب استبدال النيتروجين مع الكربون في موقف 5 من حلقة ايزالوكسازين، بل هو اختزال قوي، وبالتالي تظهر إمكانات الأكسدة القياسية منخفضة من -340 mV1،3. F420 يتكون من حلقة 5-deazaflavin و2-فوسفو-L-لاكتات رابط (F420-0). يمكن إرفاق ذيل oligoglutamate الذي يحتوي على مونومرات الغلوتامات n+1 بالجزيء (F420-n+1)4.
لفترة طويلة، ارتبط العامل المساعد F420 فقط مع Archaea وActinobacteria. وقد انقلب هذا إلى حد كبير. كشفت التحليلات الحديثة أن F420 يتم توزيعها بين الكائنات اللاهوائية والهوائية المتنوعة من فيلا بروتيوبكتيريا، كلوروفليكسي، وربما Firmicutes التي تسكن عددا لا يحصى من الموائل مثل التربة والبحيرات، والأمعاء البشرية1،5. في عام 2019 ، أظهر Braga et al.6 ، أن البروتيوباكتيريوم Paraburkholderia rhizoxinica ينتج مشتق F420 فريد من نوعه ، يحتوي على 3 فوسفوغليسيرات بدلا من ذيل 2 فوسفولاكت ، والذي قد يكون واسع الانتشار في موائل مختلفة. داخل مجال Archaea، تم العثور على F420 في عدة أنساب، بما في ذلك ميتانوجينيك7، ميتانوتروبيك8،9، وأوامر خفض الكبريتات10، ومن المفترض أن يتم إنتاجها في Thaumarchaeota11. ومن المعروف F420 كما انزيم الأكسدة الأساسية في هيدروجينوتروبيك والميثيلوتروبيك ميتانوجينيسيس. يعمل الشكل المنخفض من F420 (F420H2) كمتبرع إلكترون للحد من الميثيلينتيتراهيدروميثانوبتيرين (ميثيلين-H4MPT، مير) والميثنيل-H4MPT12,13. ويمكن أيضا أن تستخدم كناقل إلكترون في مسارات نقل الإلكترونات المستقلة H2 من الميثانوجينات التي تحتوي على السيتوكروم12,14. وعلاوة على ذلك، فإن الشكل المؤتأكسد من F420 له مضان أزرق وأخضر مميز عند الإثارة عند 420 نانومتر، مما يسهل الكشف عن الميثانوجينات مجهريا (الشكل 1). نظرا لانخفاض إمكانات الأكسدة ، يسهل F420 (1) التخفيض الخارجي طيف واسع من المركبات العضوية المتمردة أو السامة ، ‘2’ تركيب المضادات الحيوية التتراسيكلين واللينكوساميد أو السموم النباتية في الستربتوميسيتات (فيلوم أكتينوباكتيريا)، و’3′ مقاومة الإجهاد التأكسدي أو النيتروزيفي أو غيرها من الظروف غير المواتية في البكتيريا الفطرية (فيلوم أكتينوباكتيريا)1،5،15، 16,17,18,19,20,21,22. وبالتالي، تعد الاكسيدuctases المعتمدة على F420 بالمواد الحيوية الواعدة للأغراض الصناعية والصيدلانية وكذلك للمعالجة البيولوجية للبيئات الملوثة1،23. على الرغم من هذه النتائج الأخيرة ، فإن الأدوار الدقيقة للمتبرع المساعد F420 لا تزال معروفة بشكل هامشي في Actinobacteria أو الفيلا البكتيرية الأخرى.
هناك ما لا يقل عن ثلاثة مسارات لF420 التمثيل الحيوي2،6،24. في البداية ، يتم تقسيم مسار التمثيل الحيوي إلى التمثيل الحيوي 5-deazaflavin وفرع التمثيل الغذائي 2-phospholactate. يتم تصنيع الجزء التفاعلي من جزيء F420 عن طريق FO-synthase باستخدام التيروزين الركيزة و5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H)-pyrimidinedione. والنتيجة هي مستوى الريبوفلافين كروموفور FO. داخل فرع التمثيل الغذائي لللاكتات المقبول حاليا، L-lactate هو الفوسفور إلى 2-فوسفو-L-اللاكتات بواسطة كيناز L-لاكتات (CofB)؛ 2-فوسفو-L-لاكتات، بدوره، هو guanylated إلى L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine بواسطة 2-فوسفو-L-لاكتات جوانيليلترانسفيراز (CofC). في الخطوة التالية، يرتبط L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine إلى FO عن طريق نقل 2-فوسفو-L-لاكتات (CofD) لتشكيل F420-02. وأخيرا، فإن إنزيم F420-0:ɣ-الجلوتاميل ليجاز (CofE) ليغامات مونومرات إلى F420-0، وتشكيل المساعد النهائي6 في أرقام مختلفة23،25. تظهر الكائنات الحية المختلفة أنماطا مختلفة في عدد بقايا الغلوتامات المرفقة ، مع ذيول أقصر وجدت للميثانوجينات مما كانت عليه في البكتيريا الفطرية2،25،26. عموما، تظهر methanogens أطوال الذيل من اثنين إلى ثلاثة، مع ما يصل إلى خمسة في ميثانوجين الأسيتوكلاستيك، ميثانوساركينا sp.، في حين أن أطوال الذيل وجدت في Mycobacterium sp. تراوحت بين خمسة إلى سبعة بقايا الغلوتامات2،25،26،27. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن سلسلة طويلة F420 يربط إلى oxidoreductases F420 تعتمد مع تقارب أعلى من F420 سلسلة قصيرة؛ وعلاوة على ذلك، ملزمة سلسلة طويلة F420 يزيد من تقارب الركيزة ولكن يقلل من معدل دوران الإنزيمات المعنية23.
غالبا ما يعتمد الكشف عن F420 المساعد على مضانه. وبالتالي، تم فصل مشتقات الغلوتامات الأوليغو باستخدام المرحلة المعكوسة (RP) –HPLC27,28. في الآونة الأخيرة، استخدم Ney وآخرون هيدروكسيد رباعي البوتيلامونيوم ككواشف اقتران أيون لذيل الغلوتامات المشحون سلبيا لتعزيز الفصل على RP-HLPC بنجاح5. هنا، نقدم طريقة لإعداد العينات، وتحلل لاحق، واستخراج، وتنقية، وفصل، وتكميم F420 عامل مساعد ليس فقط من الثقافات النقية ولكن أيضا من عينات بيئية مختلفة (أي التربة والحمأة هاضم).
Protocol
Representative Results
Discussion
لتقييم F420 عامل مشارك من الثقافات النقية الميثانوجينية، يمكن إجراء تقييم مجهري لتصور النمو والنشاط (المجهر الفلوري) للكائنات الحية الدقيقة المعنية (الشكل 1). بالنسبة للعينات المستمدة من البيئات الطبيعية، فإن استخدام المجهر للكشف عن F420 أو قياسه كميا محدود بسبب ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر البروفيسور كولين جاكسون بامتنان على الدعم الذي تقدمه لك شركة F420 المساعدة المنقى. تم دعم هذا البحث من قبل صندوق العلوم التيرولية (TWF) وجامعة إنسبروك (Publikationsfonds). ونحن نعترف كثيرا بدعم نظام تحديد المواقع، هونج كونج، SB، GG، وHB.
Materials
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
Riferimenti
- Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).
- Bashiri, G., et al. A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes. Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).
- Grinter, R., Greening, C. Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. , (2021).
- Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium. Biochimica. 17 (22), 4583-4593 (1978).
- Ney, B., et al. The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria. The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).
- Braga, D., et al. Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420. ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).
- Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments. Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).
- Michaelis, W., et al. Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane. Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).
- Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps. Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).
- Lin, X. -. L., White, R. H. Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria. Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).
- Spang, A., et al. The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations. Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).
- Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).
- Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).
- Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri. mBio. 9 (4), (2018).
- Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea. FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).
- Purwantini, E., Daniels, L. Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).
- McCormick, J. R. D., Morton, G. O. Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species. Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).
- Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis. The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).
- Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase. Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).
- Gurumurthy, M., et al. A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).
- Greening, C., et al. Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism. Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).
- Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes. Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).
- Ney, B., et al. Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases. Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).
- Grinter, R., et al. Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria. mSystems. 5 (3), (2020).
- Peck, M. W. Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei. Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).
- Gorris, L. G., vander Drift, C. Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed. BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).
- Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species. Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).
- Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain). Microbial Ecology. 61, (2011).
- Wagner, A. O., et al. Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).
- Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
- Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
- Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
- Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis. PloS one. 5 (12), 15803 (2010).
