Extraktion von Cofaktor F420 zur Analyse der Polyglutamat-Schwanzlänge aus methanogenen Reinkulturen und Umweltproben
Summary
Eine Methode zur Extraktion des Cofaktors F420 aus Reinkulturen wurde für die flüssigkeitschromatographische Trennung und Analyse der F420-Schwanzlänge in Reinkultur- und Umweltproben optimiert.
Abstract
Der Cofaktor F420 spielt als Hydridträger eine zentrale Rolle im Primär- und Sekundärstoffwechsel vieler bakterieller und archaealer Taxa. Der Cofaktor ist vor allem für seine Rolle in der Methanogenese bekannt, wo er thermodynamisch schwierige Reaktionen ermöglicht. Da der Polyglutamat-Schwanz zwischen verschiedenen Organismen in der Länge variiert, könnten Längenprofilanalysen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Unterscheidung und Charakterisierung verschiedener Gruppen und Wege in verschiedenen Lebensräumen sein. Hier beschreibt das Protokoll die Extraktion und Optimierung der Cofaktor-F420-Detektion durch Anwendung der Festphasenextraktion in Kombination mit einer leistungsstarken Flüssigkeitschromatographie-Analyse unabhängig von kultur- oder molekularbiologischen Ansätzen. Die Methode wurde angewendet, um zusätzliche Informationen über die Expression des Cofaktors F420 aus mikrobiellen Gemeinschaften in Böden, anaeroben Schlämmen und Reinkulturen zu gewinnen und wurde durch Spiking-Experimente bewertet. Dabei gelang es der Studie, unterschiedliche F420-Schwanzlängenprofile für hydrogenotrophe und acetoklastische Methanogene in kontrollierten methanogenen Reinkulturen sowie aus Umweltproben wie anaeroben Fermenterschlamm und Böden zu generieren.
Introduction
F420 ist ein weit verbreiteter, aber oft vernachlässigter Cofaktor, der als obligater Zwei-Elektronenhydrid-Träger in primären und sekundären Stoffwechselprozessen von Archaeen und Bakterien fungiert1,2. F420 ist ein 5-Deazaflavin und strukturell flavin ähnlich, wobei seine chemischen und biologischen Eigenschaften eher mit denen von NAD+ oder NADP+ vergleichbar sind. Aufgrund der Substitution von Stickstoff durch Kohlenstoff an Position 5 des Isoalloxazinrings ist es ein starkes Reduktionsmittel und weist somit ein geringes Standard-Redoxpotential von -340 mV1,3 auf. F420 besteht aus einem 5-Deazaflavin-Ring und einem 2-Phospho-L-Lactat-Linker (F420-0). Ein Oligoglutamatschwanz, der n+1 Glutamatmonomere enthält, kann an das Molekül (F420-n+1)4 gebunden sein.
Lange Zeit wurde der Cofaktor F420 ausschließlich mit Archaeen und Actinobakterien in Verbindung gebracht. Dies wurde weitgehend rückgängig gemacht. Jüngste Analysen ergaben, dass F420 auf verschiedene anaerobe und aerobe Organismen der Phyla Proteobakterien, Chloroflexi und möglicherweise Firmicutes verteilt ist, die eine Vielzahl von Lebensräumen wie Böden, Seen und den menschlichen Darm bewohnen1,5. Im Jahr 2019 zeigten Braga et al.6, dass das Proteobakterium Paraburkholderia rhizoxinica ein einzigartiges F420-Derivat produziert, das ein 3-Phosphoglycerat anstelle eines 2-Phospholactat-Schwanzes enthält, das in verschiedenen Lebensräumen weit verbreitet sein könnte. Innerhalb der Domäne Archaea wurde F420 in mehreren Linien gefunden, darunter methanogenic7, methanotrophic8,9 und sulfatreduzierende Ordnungen10, und soll in Thaumarchaeota11 hergestellt werden. F420 ist am besten als essentielles Redox-Coenzym in der hydrogenotrophen und methylotrophen Methanogenese bekannt. Die reduzierte Form von F420 (F420H2) fungiert als Elektronendonor zur Reduktion von Methylentetrahydromethanopterin (Methylen-H4MPT, Mer) und Methenyl-H4MPT12,13. Es kann auch als Elektronenträger in H2-unabhängigen Elektronentransportwegen von Methanogenen verwendet werden, die Cytochrome enthalten12,14. Darüber hinaus weist die oxidierte Form von F420 eine charakteristische blau-grüne Fluoreszenz bei Anregung bei 420 nm auf, die den mikroskopischen Nachweis von Methanogenen erleichtert (Abbildung 1). Aufgrund seines geringen Redoxpotentials erleichtert F420 (i) die exogene Reduktion eines breiten Spektrums von ansonsten widerspenstigen oder toxischen organischen Verbindungen, (ii) die Synthese von Tetracyclin- und Lincosamid-Antibiotika oder Phytotoxinen in Streptomyceten (Stamm-Actinobakterien) und (iii) die Resistenz gegen oxidativen oder nitrosativen Stress oder andere ungünstige Bedingungen in Mykobakterien (Stamm-Actinobakterien)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Folglich sind F420-abhängige Oxidoreduktasen vielversprechende Biokatalysatoren für industrielle und pharmazeutische Zwecke sowie für die Bioremediation kontaminierter Umgebungen1,23. Trotz dieser jüngsten Erkenntnisse sind die genauen Rollen des Cofaktors F420 bei Actinobakterien oder anderen Bakterienstämmen noch marginal bekannt.
Es gibt mindestens drei Wege für die F420-Biosynthese2,6,24. Zu Beginn wird der Biosyntheseweg in eine 5-Deazaflavin-Biosynthese und einen 2-Phospholactat-Stoffwechselzweig aufgeteilt. Der reaktive Teil des F420-Moleküls wird über FO-Synthase unter Verwendung der Substrate Tyrosin und 5-Amino-6-Ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion synthetisiert. Das Ergebnis ist das Riboflavin-Level-Chromophor FO. Innerhalb des derzeit akzeptierten Laktatstoffwechselzweigs wird L-Laktat durch eine L-Laktatkinase (CofB) zu 2-Phospho-L-Lactat phosphoryliert; 2-Phospho-L-lactat wiederum wird durch 2-Phospho-L-Lactat-Guanylyltransferase (CofC) zu L-Lactyl-2-diphospho-5′-guanosin guanyliert. Im nächsten Schritt wird L-Lactyl-2-diphospho-5′-guanosin durch eine 2-Phospho-L-Lactat-Transferase (CofD) mit FO zu F420-02 verknüpft. Schließlich ligat das Enzym F420-0:ɣ-Glutamylligase (CofE) Glutamatmonomere zu F420-0 und bildet den endgültigen Cofaktor6 in unterschiedlicher Anzahl23,25. Verschiedene Organismen zeigen unterschiedliche Muster in der Anzahl der angehängten Glutamatrückstände, wobei kürzere Schwänze für Methanogene gefunden wurden als in Mykobakterien2,25,26. Im Allgemeinen zeigen Methanogene Schwanzlängen von zwei bis drei, mit bis zu fünf im acetoklastischen Methanogen Methanosarcina sp., während die Schwanzlängen in Mycobacterium sp. zwischen fünf und sieben Glutamatresten lagen2,25,26,27. Neuere Erkenntnisse zeigten jedoch, dass langkettiges F420 an F420-abhängige Oxidoreduktasen mit einer höheren Affinität bindet als kurzkettiges F420; Darüber hinaus erhöht gebundenes langkettiges F420 die Substrataffinität, verringert aber die Fluktuationsrate der jeweiligen Enzyme23.
Der Nachweis des Cofaktors F420 basiert oft auf seiner Fluoreszenz. Dabei wurden seine Oligoglutamatderivate mittels Reversed-Phase (RP)-HPLC27,28 getrennt. Kürzlich verwendeten Ney et al. Tetrabutylammoniumhydroxid als Ionenpaarungsreagenz für den negativ geladenen Glutamatschwanz, um die Trennung auf RP-HLPC erfolgreich zu verbessern5. Hier stellen wir eine Methode zur Probenvorbereitung, anschließenden Lyse, Extraktion, Reinigung, Trennung und Quantifizierung des Cofaktors F420 nicht nur aus Reinkulturen, sondern auch aus verschiedenen Umweltproben (d.h. Böden und Faulschlamm) vor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zur Beurteilung des Cofaktors F420 aus methanogenen Reinkulturen kann eine mikroskopische Auswertung durchgeführt werden, um das Wachstum und die Aktivität (Fluoreszenzmikroskopie) der beteiligten Mikroorganismen sichtbar zu machen (Abbildung 1). Für Proben aus natürlichen Umgebungen ist die Verwendung der Mikroskopie zum Nachweis oder zur Quantifizierung von F420 aufgrund von Interferenzen mit anderen fluoreszierenden Mikroorganismen, organischen und anorganischen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Prof. Colin Jackson für die Unterstützung mit gereinigtem Cofaktor F420. Diese Forschung wurde vom Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF) und der Universität Innsbruck (Publikationsfonds) unterstützt. Wir danken der Unterstützung von GPS, HK, SB, GG und HB sehr.
Materials
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
Riferimenti
- Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).
- Bashiri, G., et al. A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes. Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).
- Grinter, R., Greening, C. Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. , (2021).
- Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium. Biochimica. 17 (22), 4583-4593 (1978).
- Ney, B., et al. The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria. The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).
- Braga, D., et al. Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420. ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).
- Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments. Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).
- Michaelis, W., et al. Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane. Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).
- Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps. Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).
- Lin, X. -. L., White, R. H. Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria. Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).
- Spang, A., et al. The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations. Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).
- Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).
- Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).
- Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri. mBio. 9 (4), (2018).
- Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea. FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).
- Purwantini, E., Daniels, L. Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).
- McCormick, J. R. D., Morton, G. O. Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species. Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).
- Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis. The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).
- Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase. Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).
- Gurumurthy, M., et al. A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).
- Greening, C., et al. Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism. Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).
- Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes. Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).
- Ney, B., et al. Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases. Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).
- Grinter, R., et al. Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria. mSystems. 5 (3), (2020).
- Peck, M. W. Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei. Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).
- Gorris, L. G., vander Drift, C. Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed. BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).
- Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species. Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).
- Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain). Microbial Ecology. 61, (2011).
- Wagner, A. O., et al. Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).
- Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
- Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
- Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
- Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis. PloS one. 5 (12), 15803 (2010).
