Utvinning av cofactor F420 for analyse av polyglutamat hale lengde fra methanogenic rene kulturer og miljøprøver

Summary

En metode for utvinning av kofaktor _F420 fra rene kulturer ble optimalisert for flytende kromatografisk separasjon og analyse av _F420 hale lengde i ren kultur og miljøprøver.

Abstract

Cofactor _F420 spiller en sentral rolle som hydridbærer i den primære og sekundære metabolismen av mange bakterielle og arkaeale taxa. Kofaktoren er mest kjent for sin rolle i metanogenese, hvor det letter termodynamisk vanskelige reaksjoner. Ettersom den polyglutamat hale varierer i lengde mellom ulike organismer, lengde profil analyser kan være et kraftig verktøy for å skille og karakterisere ulike grupper og veier i ulike habitater. Her beskriver protokollen utvinning og optimalisering av kofaktor _{F420-deteksjon} ved å bruke fastfaseutvinning kombinert med høyytelses væskekromatografianalyse uavhengig av kulturelle eller molekylære biologiske tilnærminger. Metoden ble brukt for å få ytterligere informasjon om uttrykket av cofactor _F420 fra mikrobielle samfunn i jord, anaerob slam og rene kulturer og ble evaluert ved spiking eksperimenter. Dermed lyktes studien i å generere forskjellige _F420 halelengdeprofiler for hydrogenotrofiske og acetoklastiske metanogener i kontrollerte metanogene rene kulturer, så vel som fra miljøprøver som anaerob fordøyelsesslam og jord.

Introduction

_F420 er en utbredt, men ofte forsømt kofaktor, som fungerer som en obligatorisk to-elektronhydridbærer i primære og sekundære metabolske prosesser av både Arkaea og ^Bakterier1,2. _F420 er en 5-deazaflavin og strukturelt lik flavins, hvorved dens kjemiske og biologiske egenskaper er mer sammenlignbare med de av NAD ⁺ eller NADP ⁺. På grunn av substitusjon av nitrogen med karbon i posisjon 5 av isoalloksazinen, er det et sterkt reduktant, og viser dermed et lavt standard redokspotensial på -340 ^mV1,3. _F420 består av en 5-deazaflavin ring og en 2-fosfo-L-laktat linker (_F420-0). En oligoglutamathale som inneholder n +1 glutamatmonomerer kan festes til molekylet (_F420-n+1)⁴.

I lang tid har cofactor _F420 vært utelukkende forbundet med Archaea og Actinobacteria. Dette har i stor grad blitt veltet. Nyere analyser viste at _F420 er fordelt på forskjellige anaerobe og aerobe organismer av phyla Proteobacteria, Chloroflexi, og potensielt Firmicutes som bor i et utall habitater som jord, innsjøer og den menneskelige ^tarmen1,5. I 2019 viste Braga et ^al.6 at proteobakterien Paraburkholderia rhizoxinica produserer et unikt _F420-derivat, som inneholder et 3-fosfoglyserat i stedet for en 2-phospholactate hale, som kan være utbredt i ulike habitater. Innenfor domenet Archaea har _F420 blitt funnet i flere avstamninger, inkludert methanogenic7, methanotrophic8,9, og sulfatreduserende ^ordrer10, og skal produseres i Thaumarchaeota11. _F420 er best kjent som et essensielt redoks koenzym i hydrogenotrofisk og metytrofisk metanogenese. Den reduserte formen for _F420 (_F420H2) fungerer som elektrondonor for reduksjon av metylentrahydromethanopterin (metylen-H4MPT, Mer) og methenyl-H4MPT12,13. Den kan også brukes som elektronbærer i _{H2-uavhengige} elektrontransportveier av metanogener som inneholder cytokromer12,14. Videre har den oksiderte formen av _F420 en karakteristisk blågrønn fluorescens ved eksitasjon ved 420 nm, noe som letter påvisning av metanogener mikroskopisk (figur 1). På grunn av sitt lave redokspotensial letter _F420 (i) den eksogene reduksjonen av et bredt spekter av ellers tilbakevendende eller giftige organiske forbindelser, (ii) syntese av tetracyklin og lincosamid antibiotika eller fytotoksiner i streptomycetes (phylum Actinobacteria), og (iii) resistens mot oksidativt eller nitrosativt stress eller andre ugunstige forhold i mykobakterier (phylum Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Følgelig er _{F420-avhengige} oksidoreductaser lovende biokakalysatorer for industrielle og farmasøytiske formål, samt for bioremediering av forurensede ^miljøer1,23. Til tross for disse nylige funnene er de eksakte rollene til kofaktoren _F420 fortsatt marginalt kjent i Actinobacteria eller annen bakteriell phyla.

Det er minst tre veier for _F420 biosyntese2,6,24. I begynnelsen er biosyntesebanen delt inn i en 5-deazaflavin biosyntese og en 2-phospholactate metabolisme gren. Den reaktive delen av _{F420-molekylet} syntetiseres via _FO-syntase ved hjelp av substratene tyrosin og 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidindione. Resultatet er riboflavin nivå kromofor _FO. Innenfor den nåværende aksepterte laktatmetabolismegrenen er L-laktat fosforylert til 2-fosfo-L-laktat av en L-laktatkinase (CofB); 2-fosfo-L-laktat, i sin tur, er guanylated til L-laktyl-2-difosfo-5′-guanosin med 2-fosfo-L-laktat guanylyltransferase (CofC). I neste trinn er L-laktyl-2-difosfo-5′-guanosin knyttet til _FO med en 2-fosfo-L-laktat transferase (CofD) for å danne _F420-02. Til slutt ligater enzymet _F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) glutamatmonomerer til _F420-0, og danner den endelige ^cofactor6 i varierende ^tall23,25. Ulike organismer viser forskjellige mønstre i antall vedlagte glutamatrester, med kortere haler funnet for metanogener enn i mykobakterier2,25,26. Generelt viser metanogener hale lengder fra to til tre, med opptil fem i acetoklastisk methanogen, Methanosarcina sp., mens hale lengder funnet i Mycobacterium sp. varierte fra fem til syv glutamatrester2,25,26,27. Nyere funn viste imidlertid at langkjedet _F420 binder seg til _{F420-avhengige} oksidoreductaser med høyere affinitet enn kortkjedet _F420; Videre øker bundet langkjedet _F420 substrataffiniteten, men reduserer omsetningshastigheten til respektive ^enzymer23.

Påvisning av cofactor _F420 er ofte basert på fluorescens. Dermed ble dens oligo glutamatavledninger skilt ved hjelp av omvendt fase (RP)-^HPLC27,28. Nylig brukte Ney et al. tetrabutylammoniumhydroksid som et ionparerende reagens for den negativt ladede glutamathalen for å forbedre separasjonen på RP-HLPC ^vellykket5. Her presenterer vi en metode for fremstilling av prøver, etterfølgende lysis, ekstraksjon, rensing, separasjon og kvantifisering av cofactor _F420, ikke bare fra rene kulturer, men også fra forskjellige miljøprøver (dvs. jord og fordøyelsesslam).

Protocol

MERK: Ekstraksjon og analyse av cofactor F420 er en tre-trinns prosess, inkludert prøvelys, kofaktorforrensing via fastfaseutvinning (SPE), og kofaktordeteksjon via ionparert-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) med fluorescensdeteksjon. Før oppstart må materialer og reagenser klargjøres som angitt i tabell 1. 1. Prøve lysis Tilsett opptil 5 g prøve på passende rør (f.eks. 50 ml koniske rør). Tilsett 5 ml lysisbuffer (2x lagerløsning, tabell 1<…

Representative Results

Rene kulturer av Methanosarcina thermophila og Methanoculleus thermophilus, begge termofile methanogene Arkaea, ble dyrket i egnede medier som beskrevet tidligere29,30. For Methanosarcina thermophila ble metanol brukt som energikilde, mens Methanoculleus thermophilus ble dyrket på H2/CO2. Veksten ble kontrollert ved mikroskopisk evaluering, mens aktiviteten ble undersøkt via måling av metan (<s…

Discussion

For evaluering av cofactor _F420 fra metanogene rene kulturer kan det utføres en mikroskopisk evaluering for å visualisere veksten og aktiviteten (fluorescensmikroskopi) av de involverte mikroorganismer (figur 1). For prøver som stammer fra naturlige miljøer, er bruken av mikroskopi for å oppdage eller kvantifisere _F420 begrenset på grunn av forstyrrelser med andre fluorescerende mikroorganismer, organiske og uorganiske partikler. I denne sammenhengen kan utvinning…

Materials

Autoclave
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector	Shimadzu		HPLC system
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC column
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent	Phenomenex		weak anion mixed-mode polymeric sorbent
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes			SPE equipment
Vortex mixer