Extracción del cofactor F420 para el análisis de la longitud de la cola de poliglutamato a partir de cultivos puros metanogénicos y muestras ambientales

Summary

Se optimizó un método para la extracción del cofactor _F420 de cultivos puros para la separación cromatográfica líquida y el análisis de la longitud de la cola _F420 en cultivo puro y muestras ambientales.

Abstract

El cofactor _F420 juega un papel central como portador de hidruro en el metabolismo primario y secundario de muchos taxones bacterianos y arqueales. El cofactor es mejor conocido por su papel en la metanogénesis, donde facilita reacciones termodinámicamente difíciles. Como la cola de poliglutamato varía en longitud entre diferentes organismos, los análisis de perfil de longitud podrían ser una herramienta poderosa para distinguir y caracterizar diferentes grupos y vías en varios hábitats. Aquí, el protocolo describe la extracción y optimización de la detección del cofactor _F420 mediante la aplicación de la extracción en fase sólida combinada con el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento independiente de los enfoques biológicos culturales o moleculares. El método se aplicó para obtener información adicional sobre la expresión del cofactor _F420 de las comunidades microbianas en suelos, lodos anaeróbicos y cultivos puros y se evaluó mediante experimentos de aumento. De este modo, el estudio logró generar diferentes perfiles de longitud de cola _F420 para metanógenos hidrogenotróficos y acetoclásticos en cultivos puros metanogénicos controlados, así como a partir de muestras ambientales como lodos de digestor anaeróbico y suelos.

Introduction

_F420 es un cofactor generalizado pero a menudo descuidado, que funciona como un transportador obligado de hidruro de dos electrones en los procesos metabólicos primarios y secundarios de archaea y bacteria1,2. _F420 es una 5-deazaflavina y estructuralmente similar a las flavinas, por lo que sus propiedades químicas y biológicas son más comparables con las de NAD⁺ o NADP⁺. Debido a la sustitución del nitrógeno por carbono en la posición 5 del anillo de isoaloxazina, es un fuerte reductor, exhibiendo así un bajo potencial redox estándar de -340 ^mV1,3. _F420 comprende un anillo de 5-deazaflavina y un enlazador de 2-fosfo-L-lactato (_F420-0). Una cola de oligoglutamato que contiene n+1 monómeros de glutamato se puede unir a la molécula (_F420-n+1)⁴.

Durante mucho tiempo, el cofactor _F420 se ha asociado únicamente con Archaea y Actinobacteria. Esto ha sido revocado en gran medida. Análisis recientes revelaron que _F420 se distribuye entre diversos organismos anaeróbicos y aeróbicos del filo Proteobacteria, Chloroflexi y potencialmente Firmicutes que habitan una miríada de hábitats como suelos, lagos y el intestino ^humano1,5. En 2019, Braga et ^al.6, demostraron que la proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica produce un derivado _F420 único, que contiene un 3-fosfoglicerato en lugar de una cola de 2-fosfolactato, que podría estar muy extendida en varios hábitats. Dentro del dominio Archaea, _F420 se ha encontrado en varios linajes, incluyendo órdenes ^{metanogénico7}, metanotrófico8,9 y reductor de ^sulfato10, y se supone que se produce en Thaumarchaeota11. _F420 es mejor conocido como una coenzima redox esencial en la metanogénesis hidrogenotrófica y metilotrófica. La forma reducida de _F420 (_F420H2) funciona como donante de electrones para la reducción de metilentetrahidrometanopterina (metileno-H4MPT, Mer) y metenil-H4MPT12,13. También se puede utilizar como portador de electrones en vías de transporte de electrones independientes de _H2 de metanógenos que contienen ^{citocromos12,14}. Además, la forma oxidada de _F420 tiene una fluorescencia azul-verde característica al excitarse a 420 nm, lo que facilita la detección de metanógenos microscópicamente (Figura 1). Debido a su bajo potencial redox, _F420 facilita (i) la reducción exógena de un amplio espectro de compuestos orgánicos recalcitrantes o tóxicos, (ii) la síntesis de antibióticos o fitotoxinas de tetraciclina y lincosamida en estreptomicetos (filo Actinobacteria), y (iii) resistencia al estrés oxidativo o nitrosativo u otras condiciones desfavorables en micobacterias (filo Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. En consecuencia, las oxidorreductasas dependientes de _F420 son biocatalizadores prometedores para fines industriales y farmacéuticos, así como para la biorremediación de ambientes ^{contaminados1,23}. A pesar de estos hallazgos recientes, las funciones exactas del cofactor _F420 todavía se conocen marginalmente en Actinobacteria u otros filos bacterianos.

Existen al menos tres vías para la biosíntesis _F4202,6,24. Al principio, la vía de biosíntesis se divide en una biosíntesis de 5-deazaflavina y una rama del metabolismo de 2-fosfolactato. La parte reactiva de la molécula _F420 se sintetiza a través de la _FO-sintasa utilizando los sustratos tirosina y 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pirimidinediona. El resultado es el cromóforo de nivel de riboflavina _FO. Dentro de la rama del metabolismo del lactato actualmente aceptada, el L-lactato es fosforilado a 2-fosfo-L-lactato por una L-lactato quinasa (CofB); El 2-fosfo-L-lactato, a su vez, es guanilado a L-lactilo-2-difosfo-5′-guanosina por la 2-fosfo-L-lactato guanililtransferasa (CofC). En el siguiente paso, L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine está unida a _FO por una 2-fosfo-L-lactato transferasa (CofD) para formar _F420-02. Finalmente, la enzima _F420-0:ɣ-glutamil ligasa (CofE) liga los monómeros de glutamato a _F420-0, formando el cofactor ^final6 en números ^{variables23,25}. Diferentes organismos muestran diferentes patrones en el número de residuos de glutamato adheridos, encontrándose colas más cortas para los metanógenos que en las micobacterias2,25,26. En general, los metanógenos muestran longitudes de cola de dos a tres, con hasta cinco en el metanógeno acetoclástico, Methanosarcina sp., mientras que las longitudes de cola encontradas en Mycobacterium sp. variaron de cinco a siete residuos de glutamato2,25,26,27. Sin embargo, hallazgos recientes mostraron que _F420 de cadena larga se une a oxidorreductasas dependientes de _F420 con una afinidad más alta que _F420 de cadena corta; además, _F420 de cadena larga unida aumenta la afinidad del sustrato pero disminuye la tasa de recambio de las enzimas ^{respectivas23}.

La detección del cofactor _F420 a menudo se basa en su fluorescencia. De este modo, sus derivados de oligo glutamato se separaron mediante ^hplc27,28 de fase invertida (RP^). Recientemente, Ney et al. utilizaron hidróxido de tetrabutilamonio como reactivo de emparejamiento de iones para la cola de glutamato cargada negativamente para mejorar la separación en RP-HLPC con ^éxito5. Aquí, presentamos un método para la preparación de muestras, lisis posterior, extracción, purificación, separación y cuantificación del cofactor _F420 no solo de cultivos puros sino también de diferentes muestras ambientales (es decir, suelos y lodos digestores).

Protocol

NOTA: La extracción y el análisis del cofactor F420 es un proceso de tres pasos que incluye la lisis de la muestra, la prepurificación del cofactor a través de la extracción en fase sólida (SPE) y la detección del cofactor a través de RP-HPLC emparejado con iones (IP-RP-HPLC) con detección de fluorescencia. Antes de comenzar, prepare los materiales y reactivos como se indica en la Tabla 1. 1. Lisis de la muestra Agregue hasta 5 g de muestra a los …

Representative Results

Los cultivos puros de Methanosarcina thermophila y Methanoculleus thermophilus, ambos arqueas metanogénicas termófilas, se cultivaron en medios adecuados como se describió anteriormente29,30. Para Methanosarcina thermophila, el metanol se utilizó como fuente de energía, mientras que Methanoculleus thermophilus se cultivó con H2 / CO2. El crecimiento se comprobó mediante evaluación microsc?…

Discussion

Para la evaluación del cofactor _F420 a partir de cultivos metanogénicos puros, se puede realizar una evaluación microscópica para visualizar el crecimiento y la actividad (microscopía de fluorescencia) de los microorganismos involucrados (Figura 1). Para muestras procedentes de entornos naturales, el uso de microscopía para detectar o cuantificar _F420 es limitado debido a interferencias con otros microorganismos fluorescentes, partículas orgánicas e inorgánicas…

Materials

Autoclave
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector	Shimadzu		HPLC system
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC column
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent	Phenomenex		weak anion mixed-mode polymeric sorbent
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes			SPE equipment
Vortex mixer