En metod för utvinning av kofaktor F420 från rena kulturer optimerades för vätskekromatografisk separation och analys av F420 svanslängd i rena odlings- och miljöprover.
Kofaktorn F420 spelar en central roll som hydridbärare i den primära och sekundära metabolismen av många bakteriella och ålderdomliga taxa. Kofaktorn är mest känd för sin roll i metanogenes, där den underlättar termodynamiskt svåra reaktioner. Eftersom polyglutamate svansen varierar i längd mellan olika organismer, kan längdprofilanalyser vara ett kraftfullt verktyg för att skilja och karakterisera olika grupper och vägar i olika livsmiljöer. Här beskriver protokollet extraktion och optimering av kofaktor F420 detektion genom att tillämpa solid fas extraktion i kombination med högpresterande vätskekromatografi analys oberoende av kulturella eller molekylära biologiska metoder. Metoden tillämpades för att få ytterligare information om uttrycket av kofaktor F420 från mikrobiella samhällen i jordar, anaeroba slam och rena kulturer och utvärderades genom spikningsexperiment. Därmed lyckades studien generera olika F420 svanslängdsprofiler för hydrogenotrofiska och acetoclasta metanogener i kontrollerade metanogena rena kulturer samt från miljöprover som anaerobt rötslam och jordar.
F420 är en utbredd men ofta försummad kofaktor, som fungerar som en obligatorisk tvåelektronhydridbärare i primära och sekundära metaboliska processer av både Arkéer och Bakterier1,2. F420 är en 5-deazaflavin och strukturellt lik flavins, varigenom dess kemiska och biologiska egenskaper är mer jämförbara med NAD + eller NADP +. På grund av substitutionen av kväve med kol vid position 5 i isoalloxazinringen är det ett starkt reduktant, vilket uppvisar en låg standard redox potential på -340 mV1,3. F420 består av en 5-deazaflavin ring och en 2-phospho-L-laktat linker (F420-0). En oligoglutamat svans som innehåller n +1 glutamat monomerer kan fästas på molekylen (F420-n+1)4.
Under lång tid har kofaktorn F420 endast associerats med Archaea och Actinobacteria. Detta har till stor del omkullkastats. Nyligen genomförda analyser visade att F420 distribueras mellan olika anaeroba och aeroba organismer av phyla Proteobacteria, Chloroflexi och potentiellt Firmicutes som bor i en myriad av livsmiljöer som jordar, sjöar och den mänskliga tarmen1,5. År 2019 visade Braga et al.6 att proteobakterien Paraburkholderia rhizoxinica producerar ett unikt F420-derivat, innehållande ett 3-fosfosfolat istället för en 2-phossfolactate svans, som kan vara utbredd i olika livsmiljöer. Inom området Archaea har F420 hittats i flera härstamningar, inklusive mekanogen7, methanotrofisk8,9 och sulfatreducerande order10, och är tänkt att produceras i Thaumarchaeota11. F420 är mest känd som en viktig redox coenzyme i hydrogenotrofisk och metotrofisk metanogenes. Den reducerade formen av F420 (F420H2) fungerar som elektrondonator för minskning av metylenetrahydrometanopterin (metylen-H4MPT, Mer) och methenyl-H4MPT12,13. Det kan också användas som elektronbärare i H2-oberoende elektrontransportvägar för metanogener som innehåller cytokromer12,14. Dessutom har den oxiderade formen av F420 en karakteristisk blågrön fluorescens vid excitation vid 420 nm, vilket underlättar detektion av metanogener mikroskopiskt (figur 1). På grund av sin låga redoxpotential underlättar F420 i) den exogena minskningen av ett brett spektrum av annars motsträviga eller giftiga organiska föreningar, ii) syntes av tetracyklin- och linkosamidantibiotika eller fytotoxiner i streptomyceter (fylum Actinobacteria) och iii) resistens mot oxidativ eller nitrosativ stress eller andra ogynnsamma förhållanden i mykobakterier (fylum Actinobacteria)1,5, 16,17,18,19,20,21,22. Följaktligen är F420-beroende oxidoreduktaser lovande biokatalysanter för industriella och farmaceutiska ändamål samt för bioremediation av förorenade miljöer1,23. Trots dessa senaste resultat är de exakta rollerna för kofaktorn F420 fortfarande marginellt kända i Actinobacteria eller annan bakteriell phyla.
Det finns minst tre vägar för F420 biosyntes2,6,24. I början delas biosyntesvägen upp i en 5-deazaflavin biosyntes och en 2-fosfolactate metabolism gren. Den reaktiva delen av F420-molekylen syntetiseras via FO-syntas med hjälp av substraten tyrosin och 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedion. Resultatet är riboflavin nivå kromofor FO. Inom den för närvarande accepterade laktatmetabolismgrenen fosforyleras L-laktat till 2-fosfato-L-laktat av en L-laktatkinas (CofB); 2-fosfatfos-L-laktat, i sin tur, är guanylerad till L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosin av 2-phospho-L-laktat guanylyltransferase (CofC). I nästa steg är L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosin kopplad till FO genom en 2-phospho-L-laktattransferas (CofD) för att bilda F420-02. Slutligen ligates enzymet F420-0:ķ-glutamyl ligase (CofE) glutamatmonomerer till F420-0 och bildar den slutliga kofaktorn6 i varierande antal23,25. Olika organismer uppvisar olika mönster i antalet bifogade glutamatrester, med kortare svansar som finns för metanogener än i mykobakterier2,25,26. I allmänhet visar metanogener svanslängder från två till tre, med upp till fem i acetoclastic methanogen, Methanosarcina sp., medan svanslängder som finns i Mycobacterium sp. varierade från fem till sju glutamatrester2,25,26,27. De senaste resultaten visade dock att långkedjiga F420 binder till F420-beroende oxidoreduktaser med högre affinitet än kortkedjiga F420. Dessutom ökar den bundna långkedjiga F420 substrattillhörigheten men minskar omsättningshastigheten för respektive enzymer23.
Detektion av kofaktor F420 baseras ofta på dess fluorescens. Därmed separerades dess oligo glutamat derivat med hjälp av omvänd fas (RP)-HPLC27,28. Nyligen använde Ney et al. tetrabutylammoniumhydroxid som ett jonparningsreagens för den negativt laddade glutamat svansen för att förbättra separationen på RP-HLPC framgångsrikt5. Här presenterar vi en metod för beredning av prover, efterföljande lys, extraktion, rening, separation och kvantifiering av kofaktor F420 inte bara från rena kulturer utan också från olika miljöprover (dvs. jordar och rötslam).
För utvärdering av kofaktor F420 från methanogenic rena kulturer kan en mikroskopisk utvärdering utföras för att visualisera tillväxt och aktivitet (fluorescensmikroskopi) av de berörda mikroorganismerna (figur 1). För prover som härrör från naturliga miljöer är användningen av mikroskopi för att detektera eller kvantifiera F420 begränsad på grund av störningar med andra fluorescerande mikroorganismer, organiska och oorganiska partiklar. I detta samma…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar tacksamt prof. Colin Jackson för stödet med renad kofaktor F420. Denna forskning stöddes av Tyrolska vetenskapsfonden (TWF) och Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Vi är mycket medvetna om stödet från GPS, HK, SB, GG och HB.
Autoclave | |||
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
Vortex mixer |