Produzione rapida, economica e semplice di lisato privo di cellule batteriche

Summary

Questo protocollo descrive un metodo rapido e semplice per produrre lisato batterico per l'espressione genica senza cellule, utilizzando un ceppo ingegnerizzato di Escherichia coli e richiedendo solo attrezzature di laboratorio standard.

Abstract

L'espressione genica senza cellule offre il potere della biologia senza le complicazioni di un organismo vivente. Sebbene esistano molti di questi sistemi di espressione genica, la maggior parte sono piuttosto costosi da acquistare e / o richiedono attrezzature speciali e competenze finemente affinate per produrre in modo efficace. Questo protocollo descrive un metodo per produrre lisato batterico privo di cellule che supporta alti livelli di espressione genica, utilizzando solo apparecchiature di laboratorio standard e richiedendo un'elaborazione minima. Il metodo utilizza un ceppo di Escherichia coli che produce un'endolisina che non influisce sulla crescita, ma che lisa in modo efficiente un pellet cellulare raccolto seguendo un semplice ciclo di congelamento-disgelo. L'unica ulteriore elaborazione richiesta è una breve incubazione seguita da centrifugazione per eliminare l'autolizzato dai detriti cellulari. I circuiti genici dinamici possono essere ottenuti attraverso l'espressione eterologa della proteasi ClpX nelle cellule prima della raccolta. Un ceppo di E. coli privo del gene lacZ può essere utilizzato per applicazioni di biorilevamento ad alta sensibilità e prive di cellule utilizzando una lettura colorimetrica o fluorescente. L'intero protocollo richiede solo 8-9 ore, con solo 1-2 ore di lavoro pratico dall'inoculazione al completamento. Riducendo i costi e i tempi per ottenere lisato senza cellule, questo metodo dovrebbe aumentare l'accessibilità economica dell'espressione genica senza cellule per varie applicazioni.

Introduction

L'espressione genica nei lisati privi di cellule ha diversi vantaggi rispetto all'utilizzo di cellule vive^1,2,3,4. I lisati possono essere facilmente modificati biochimicamente e utilizzati in condizioni che potrebbero essere dannose o impossibili da ottenere nelle cellule vive. I circuiti di espressione genica non devono competere o competere con i processi biologici dell'ospite e testare nuovi circuiti genetici è semplice come aggiungere DNA. Per questi motivi, l'espressione genica cell-free ha trovato varie applicazioni, dai biosensori

Protocol

1. Preparare supporti e buffer.

1. Preparare 2xYTPG medio.
   1. Mescolare 62 g di polvere 2xYT, 5,99 g di fosfato di potassio monobasico, 13,93 g di fosfato di potassio bibasico e acqua deionizzata a 2 L.
   2. Autoclave su ciclo liquido con un tempo di esposizione di 30 min^14.
   3. A 400 mL di 2xYTP media da 1.1.2, aggiungere 7,2 g di D-glucosio (destrosio) e mescolare fino a quando non si scioglie.
   4. Filtrare-sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 μm.
2. Preparare il buffer S30A.
   1. Mescolare Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM di concentrazione finale), glutammato di potassio (60 mM finale) e glut....

Results

I risultati rappresentativi possono essere osservati utilizzando l'autolizzato per esprimere GFP da un plasmide che esprime costitutivamente, qui pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, e registrando un corso temporale di fluorescenza GFP in un lettore di piastre (Figura 1B). Una serie di diluizione di DNA plasmidico ha trovato una forte espressione anche a 1 nM di DNA. Rispetto ad un lisato disponibile in commercio, l'autolizzato può produrre una maggiore resa totale e raggiungere un maggiore tas.......

Discussion

Il protocollo qui descritto produce lisato batterico altamente attivo per l'espressione genica senza cellule. La chiave è utilizzare cellule portatrici del plasmide pAD-LyseR, che esprime citosolicamente l'endolisina del fago lambda. Queste cellule vengono potenziate per lisarsi dopo la permeabilizzazione della membrana interna, consentendo all'endolisina l'accesso alla parete cellulare, che il metodo ottiene attraverso un semplice ciclo di congelamento-disgelo. Poiché le cellule si lisano efficacemente, il prodotto vien.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT media	EMD Millipore	4.85008	o equivalente
3-PGA	Sigma Aldrich	P8877	o
equivalente unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-15, cutoff 3 kDa	Millipore Sigma	UFC900308	opzionale, può essere utilizzato per concentrare il lisato, selezionare la capacità del concentratore appropriata per il volume da concentrare
ampicillina	Sigma Aldrich	A0166-5G	o carbenicillina, una variante più stabile
ATP	Sigma Aldrich	A8937	o cAMP equivalente
	Sigma Aldrich	A9501	o
CoA	Sigma Aldrich	C4282	o CTP equivalente
	United States Biosciences	14121	o
D-glucosio (destrosio) equivalente Fisher	Scientific	AAA1749603	o
equivalente ditiotreitolo (DTT)Sigma	Aldrich	D0632-1G	o
equivalente E. coli BL21-Gold (DE3) veicolante di pAD-LyseR,	Addgene	99244
E. coli, BL21-Gold (DE3) &; lacZ che trasporta pAD-LyseR,	Addgene	99245
Acido folinico	Sigma Aldrich	F7878	o GTP
	equivalente, United States Biosciences	16800	o HEPES equivalente
	Sigma Aldrich	H3375-25G	o LB media equivalente
	Fisher Scientific	DF0446075	o glutammato
	di magnesio equivalenteSigma Aldrich	49605-250G	o equivalente
NAD	Sigma Aldrich	N6522	o
equivalente glutammato di potassio	Sigma	Aldrich G1501-100G	o
equivalente idrossido di potassio (KOH)	Sigma Aldrich	221473-25G	per la regolazione del pH
fosfato di potassio bibasico	Fisher Scientific	BP363-500	o equivalente
fosfato di potassio monobasico	Fisher Scientific	BP362-500	o equivalente
Spermidina	Sigma Aldrich	85558	o equivalente
Tris-HCl	Fisher Scientific	9310500GM	o
equivalente miscela di tRNA	Roche	10109541001	o UTP equivalente
	United States Biosciences	23160	o equivalente