Entwicklung eines Lateral Flow Immunochromatographic Strip für den schnellen und quantitativen Nachweis niedermolekularer Verbindungen
Abstract
Membranbasierte Lateral-Flow-Immunchromatographiestreifen (ICSs) sind nützliche Werkzeuge für die kostengünstige Selbstdiagnose und wurden effizient auf die Erkennung von Toxinen, physiologischen Indizes und klinischen Biomarkern angewendet. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die Schritte zur Entwicklung eines schnellen, empfindlichen und quantitativen Lateral-Flow-Immunoassays (mit AuNPs als Marker und mAbs als Sonde). Das Verfahren beschreibt die Herstellung und Charakterisierung von kolloidalem Gold, die Synthese des AuNP-mAb-Konjugats, den Aufbau des immunchromatographischen Streifens und die methodische Untersuchung des Assays. Die Ergebnisse zeigten, dass die endgültigen Streifen weiter für die schnelle und bequeme Selbstdiagnose eines kleinen Moleküls verwendet werden können, was ein alternatives Werkzeug bei der schnellen und präzisen Analyse physiologischer und biologischer Indizes sein kann.
Introduction
Membranbasierte Lateral Flow Immunochromatographic Strips (ICSs) sind nützliche Werkzeuge für eine kostengünstige und schnelle Erkennung. Die Nitrocellulosemembran als Träger und kolloidales Gold als Marker für schnelldiagnostische Reagenzien der Immunchromatographie sind die am häufigsten verwendete POCT-Methode (Point of Care Testing), und der Testumfang des Projekts ist breiter. Von ihrer ursprünglichen Anwendung bei der Überwachung während der Schwangerschaft wurde ihre Verwendung erweitert, um Blutgerinnungszustand1,2, Myokardverletzung3, Veterinärmedizin4, Pestizidrückstände5, Infektionskrankheiten6 und Arzneimittelkonzentrationen zu überwachen. Weitere Arten von Proben können beurteilt werden, einschließlich Urin, Speichel, Vollblut, Serum und andere Körperflüssigkeiten7,8,9.
In den letzten Jahren wurden zahlreiche neuartige Assays zum Nachweis von Biomarkern bei der Diagnose von Erkrankungen entwickelt, darunter HPLC, UPLC, LC-MS und ELISA, die sensibel und genau, glaubwürdig und spezifisch sind. Diese Methoden erfordern jedoch eine ausgeklügelte Instrumentierung, eine komplexe Vorverarbeitung und zeitaufwändige Behandlungen9. Daher ist die Entwicklung einer schnelleren und bequemeren Point-of-Care-Diagnosestrategie für den Selbst- und Echtzeitnachweis von medizinischen Wirkstoffen dringend10,11.
Die Popularität von ICS, insbesondere für gängige Tests, wird durch ihre Benutzerfreundlichkeit angetrieben, da sie keine Profis oder aufwendige instrumentenaufwändige Setups erfordern12. Mit anderen Worten, Menschen, die keine spezielle Ausbildung haben, können Streifen oder Selbsttestsbedienen 13. Die Ergebnisse des Tests können in 5 Minuten erhalten werden, was bedeutet, dass es für Standortinspektionen verwendet werden kann14. Darüber hinaus könnten nach unseren Berechnungen die Kosten für Streifen niedriger als 1 RMB15sein, was bedeutet, dass die Tests kostengünstig sind, um16zu fördern. Daher ist das ICS ein relativ genaues, einfaches und kostengünstiges Einweggerät. ICSs auf Basis von kolloidalem Gold17,18 werden auch bei der schnellen COVID-19-Erkennung eingesetzt.
Das Prinzip des ICS kann in Sandwich-ICS und wettbewerbsfähige ICS unterteilt werden. Abbildung 1A ist ein schematisches Diagramm des Sandwich-ICS, das hauptsächlich zum Nachweis makromolekularer Substanzen wie Proteine, einschließlich Tumormarker, Entzündungsfaktoren und humanes Chorion-Gonadotropin (HCG, Early Pregnancy Antigen) verwendet wird. Bei dieser Methode werden gepaarte Antikörper verwendet, die auf verschiedene Epitope des Antigens abzielen, und der Capture-Antikörper wird auf der NC-Membran als Testlinie getrocknet. Markierte Antikörper werden auf dem Konjugatpad getrocknet, und sekundäre Antikörper werden als Kontrolllinie verwendet.
Abbildung 1B ist ein schematisches Diagramm des kompetitiven ICS, das hauptsächlich zum Nachweis niedermolekularer Substanzen verwendet wird (MWCO < 2000 Da). Das Beschichtungsantigen wird als Testlinie auf der NC-Membran fixiert und der markierte Antikörper auf dem Konjugatpad getrocknet. Während des Nachweises fließen die Probe und der markierte Antikörper unter Kapillarwirkung durch die Nachweislinie, und das beschichtete Antigen bindet kompetitiv freies Antigen in der Probe und entwickelt eine rote Farbe auf der Nachweislinie.
Kürzlich haben wir das Verfahren der monoklonalen Antikörperbildung gegen Naturprodukte beschrieben19. In dieser Arbeit entwickelten wir einen neuartigen Lateral-Flow-Immunoassay auf Basis des vorbereiteten Anti-SSD mA20 für eine schnelle Vor-Ort-Erkennung. Die Ergebnisse zeigen, dass der Immunchromatographie-Assay ein unverzichtbares und bequemes Werkzeug zum Nachweis von aus Naturprodukten gewonnenen Verbindungen ist.
Abbildung 1 Schematische Darstellung des Immunchromatographie-Assays (A) Sandwich-immunchromatographische Teststreifen. (B) Indirekte kompetitive immunchromatographische Teststreifen. Diese Zahl wurde modifiziert von Zhang et al.,201821. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Herstellung von mAbs gegen aus Naturprodukten gewonnene kleine Moleküle vor. Die wesentlichen Schritte und die Angelegenheiten, die in der Prozedur beachtet werden müssen, wurden skizziert, und wir haben den Nutzen dieses Protokolls am Beispiel der niedermolekularen SSD demonstriert. Beispielspektren, TEM-Bilder, quantitative Ergebnisse und methodische Untersuchungen werden in repräsentativen Daten gezeigt. Daher haben wir gezeigt, dass die hier vorgestellte kolloidale Go…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Sonderfonds für Grundlagenforschungsfonds der mit zentralen Abteilungen verbundenen Hochschulen unterstützt. Wir schätzen die Unterstützung des Classical Prescription Basic Research Teams der Beijing University of Chinese Medicine.
Materials
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
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