माइटोकॉन्ड्रियल रोग मॉडलिंग के लिए मानव मस्तिष्क Organoids की पीढ़ी
Summary
हम मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी और माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के मॉडलिंग में उनके उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल रोग चयापचय की जन्मजात त्रुटियों के सबसे बड़े वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं और वर्तमान में लाइलाज हैं। ये बीमारियां न्यूरोडेवलपमेंटल दोषों का कारण बनती हैं जिनके अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट किया जाना बाकी है। एक प्रमुख रोडब्लॉक प्रभावी मॉडल की कमी है जो रोगियों में देखी जाने वाली प्रारंभिक शुरुआत न्यूरोनल हानि को दोहराता है। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) की तकनीक में प्रगति तीन आयामी (3 डी) मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी को सक्षम करती है जिसका उपयोग तंत्रिका तंत्र के विकास और संगठन पर बीमारियों के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इन लेखकों सहित शोधकर्ताओं ने हाल ही में माइटोकॉन्ड्रियल विकारों को मॉडल करने के लिए मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स पेश किए हैं। यह पेपर मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की मजबूत पीढ़ी और माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग और इमेजिंग विश्लेषण में उनके उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करता है। ये प्रयोग चयापचय और विकासात्मक शिथिलताओं की जांच करने के लिए मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के उपयोग की अनुमति देंगे और माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों की न्यूरोनल विकृति को विच्छेदित करने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रियल रोग चयापचय की जन्मजात त्रुटियों के सबसे बड़े वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं1। वे विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल प्रक्रियाओं को बाधित करने वाले आनुवंशिक उत्परिवर्तन के कारण होते हैं, जिसमें ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (OXPHOS) 2, श्वसन श्रृंखला असेंबली, माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए प्रतिलेखन या प्रतिकृति 3 शामिल हैं। ऊर्जा आवश्यकताओं वाले ऊतक विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन 4 से प्रभावित होते हैं। तदनुसार, माइटोकॉन्ड्रियल रोगों वाले रोगी आमतौर पर शुरुआती शुरुआत न्यूरोलॉजिकल अभिव्यक्तियों को विकसित करते हैं।
वर्तमान में माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों से प्रभावित बच्चों के लिए कोई उपचार उपलब्ध नहीं है5। माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के दवा विकास के लिए एक प्रमुख बाधा मानव रोग course6 recapitulating प्रभावी मॉडल की कमी है। वर्तमान में अध्ययन किए गए जानवरों के कई मॉडल रोगियों में मौजूद न्यूरोलॉजिकल दोषों को प्रदर्शित नहीं करते हैं7। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के न्यूरोनल पैथोलॉजी के अंतर्निहित तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आए हैं।
हाल के अध्ययनों ने माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों से प्रभावित रोगियों से आईपीएससी उत्पन्न किया और रोगी-विशिष्ट न्यूरोनल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग किया। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल रोग, लेह सिंड्रोम से जुड़े आनुवंशिक दोषों को सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स 8,9, प्रोटीन संश्लेषण 10, और कैल्शियम होमियोस्टैसिस 9,11 में विपथन का कारण पाया गया है। इन रिपोर्टों ने माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों में होने वाली न्यूरोनल हानि पर महत्वपूर्ण यांत्रिक सुराग प्रदान किए, जिससे इन लाइलाज बीमारियों के लिए दवा की खोज का मार्ग प्रशस्त हुआ।
दो आयामी (2 डी) संस्कृतियां, हालांकि, 3 डी अंगों की वास्तुकला जटिलता और क्षेत्रीय संगठन की जांच को सक्षम नहीं करती हैं। इस अंत तक, रोगी-विशिष्ट iPSCs14 से व्युत्पन्न 3 डी मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उपयोग शोधकर्ताओं को अतिरिक्त महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने की अनुमति दे सकता है और इस प्रकार यह विच्छेदन करने में मदद कर सकता है कि माइटोकॉन्ड्रियल रोग तंत्रिका तंत्र के विकास और कार्य को कैसे प्रभावित करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों की जांच करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स को नियोजित करने वाले अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के न्यूरोडेवलपमेंटल घटकों को उजागर करना शुरू कर रहे हैं।
माइटोकॉन्ड्रियल रोग, माइटोकॉन्ड्रियल एन्सेफैलोपैथी, लैक्टिक एसिडोसिस, और स्ट्रोक जैसे एपिसोड सिंड्रोम (MELAS) से जुड़े उत्परिवर्तन ों को ले जाने वाले रीढ़ की हड्डी के ऑर्गेनोइड्स ने दोषपूर्ण न्यूरोजेनेसिस और विलंबित मोटर न्यूरॉन भेदभाव 16 दिखाया। माइटोकॉन्ड्रियल रोग, लेह सिंड्रोम के साथ रोगियों से व्युत्पन्न कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड्स ने कम आकार, तंत्रिका उपकला कली पीढ़ी में दोष, और कॉर्टिकल आर्किटेक्चर 17 के नुकसान को दिखाया। लेह सिंड्रोम के रोगियों से मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स से पता चला है कि रोग दोष तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं के स्तर पर शुरू होते हैं, जो माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय के लिए प्रतिबद्ध नहीं हो सकते हैं, जिससे अनियमित न्यूरोनल ब्रांचिंग और मॉर्फोजेनेसिस 18 होता है। इस प्रकार, तंत्रिका पूर्वज माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के लिए एक सेलुलर चिकित्सीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, और उनके माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बढ़ावा देने वाली रणनीतियां तंत्रिका तंत्र के कार्यात्मक विकास का समर्थन कर सकती हैं।
मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों के न्यूरोडेवलपमेंटल घटकों को उजागर करने में मदद कर सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल रोगों को मुख्य रूप से शुरुआती शुरुआत न्यूरोडीजेनेरेशन 5 के रूप में माना जाता है। हालांकि, न्यूरोडेवलपमेंटल दोष माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों से प्रभावित रोगियों में भी मौजूद हैं, जिसमें विकास ता्मक देरी और संज्ञानात्मक हानि शामिल है। रोगी-विशिष्ट मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स इन पहलुओं को संबोधित करने में मदद कर सकते हैं और स्पष्ट कर सकते हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल रोग मानव मस्तिष्क के विकास को कैसे प्रभावित कर सकते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन अन्य अधिक सामान्य न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में भी एक पैथोजेनेटिक भूमिका निभा सकता है, जैसे कि अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, और हंटिंगटन रोग 4। इसलिए, मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके न्यूरोडेवलपमेंट में माइटोकॉन्ड्रियल दोषों के प्रभाव को स्पष्ट करना भी उन बीमारियों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। यह पेपर पुनरुत्पादक मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के रोग मॉडलिंग के संचालन के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पुनरुत्पादक पीढ़ी और माइटोकॉन्ड्रियल रोग मॉडलिंग के लिए उनके उपयोग का वर्णन करता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित work20 के आध?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए मिरियम Bünning धन्यवाद. हम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 से A.P.), स्पार्क और बर्लिन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), The United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.), और जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (BMBF) (E) से समर्थन स्वीकार करते हैं। जैव युवा अन्वेषक अनुदान AZ 031L0211 A.P.) के लिए). C.R.R. की प्रयोगशाला में काम DFG द्वारा समर्थित था (2795 के लिए “तनाव के तहत Synapses”, Ro 2327/13-1)।
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
Riferimenti
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