ミトコンドリア病モデルのためのヒト脳オルガノイドの生成
Summary
ヒト誘導多能性幹細胞由来の脳オルガノイドの生成とミトコンドリア病のモデル化におけるその使用に関する詳細なプロトコルについて述べています。
Abstract
ミトコンドリア病は、代謝の生まれ変わりエラーの最大のクラスを表し、現在不治です。これらの疾患は、根本的なメカニズムが解明されたままの神経発達上の欠陥を引き起こす。主要な障害は、患者に見られる早期発症神経障害を再現する効果的なモデルの欠如である。誘導多能性幹細胞(iPSC)の技術の進歩により、神経系の発達と組織に対する疾患の影響を調べるための3次元(3D)脳オルガノイドの生成が可能になります。これらの著者を含む研究者は、最近、ミトコンドリア障害をモデル化するためにヒト脳オルガノイドを導入しました。本論文は、ヒトiPSC由来の脳オルガノイドの堅牢な生成と、ミトコンドリアの生体エネルギープロファイリングおよびイメージング分析におけるその使用に関する詳細なプロトコルを報告する。これらの実験は、脳オルガノイドを使用して代謝および発達の機能不全を調査することを可能にし、ミトコンドリア病の神経病理学を解剖するための重要な情報を提供するかもしれない。
Introduction
ミトコンドリア病は、代謝の内生誤差の最大のクラスを表します1.それらは、酸化リン酸化(OXPHOS)2、呼吸連鎖集合体、ミトコンドリアダイナミクス、ミトコンドリアDNA転写または複製を含む異なるミトコンドリアプロセスを破壊する遺伝子変異によって引き起こされる。エネルギー要件を有する組織は、特にミトコンドリア機能不全4の影響を受ける。したがって、ミトコンドリア病の患者は、典型的には早期発症の神経学的症状を発症する。
現在、ミトコンドリア病の影響を受ける小児に対する治療法はない5。ミトコンドリア病の薬剤開発の大きな障害は、ヒト疾患コース6を再現する有効なモデルの欠如である。現在研究されている動物モデルのいくつかは、患者7に存在する神経学的欠陥を示さない。したがって、ミトコンドリア病の神経病理学の根底にあるメカニズムはまだ完全には理解されていない。
最近の研究では、ミトコンドリア病の影響を受けた患者からiPSCを生成し、これらの細胞を使用して患者特異的神経細胞を得た。例えば、ミトコンドリア病に伴う遺伝的欠陥、リー症候群、細胞内の収差を生じさせるのが分かっており、細胞内の生体エネルギー8,9、タンパク質合成10、及びカルシウム恒常性9,11に収差を生じる。これらの報告は、ミトコンドリア病で起こる神経障害に関する重要な機械化的手がかりを提供し、これらの不治病の創薬への道を開いた12。
しかし、2次元(2D)文化は、3D臓器13の建築の複雑さと地域組織の調査を可能にしません。このことから、患者固有のiPSCs14 に由来する3D脳オルガノイドを使用することで、研究者はさらなる重要な情報を得ることができ、それによってミトコンドリア病が神経系の発達および機能にどのような影響を与えるかを解剖するのに役立つ可能性がある15。ミトコンドリア病を調べるiPSC由来の脳オルガノイドを用いた研究は、ミトコンドリア病の神経発達成分を解明し始めている。
ミトコンドリア病に関連する変異を運ぶ脊髄オルガノイドは、ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード症候群(MELAS)、神経新生の欠陥および遅れた運動ニューロン分化を示した16。ミトコンドリア病患者由来の皮質オルガノイドは、リー症候群、サイズの縮小、神経上皮芽発生の欠損、皮質アーキテクチャの喪失を示した17。リー症候群患者の脳オルガノイドは、疾患欠陥がミトコンドリア代謝にコミットできない神経前駆細胞のレベルで開始し、異常な神経細胞の分岐および形態形成を引き起こすことを示した。したがって、神経前駆物質はミトコンドリア病の細胞治療標的を表し、ミトコンドリア機能を促進する戦略は神経系の機能的発達を支え得る。
脳オルガノイドの使用は、ミトコンドリア病の神経発達成分を明らかにするのに役立つかもしれません.ミトコンドリア病は、主に早期発症神経変性症として考えられる5。しかし、神経発達上の欠陥は、発達遅延および認知障害を含むミトコンドリア病の影響を受ける患者にも存在する19。患者固有の脳オルガノイドは、これらの側面に対処し、ミトコンドリア病が人間の脳の発達にどのような影響を与えるかを解明するのに役立つ可能性があります。ミトコンドリア機能障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの他のより一般的な神経疾患においても病態的役割を果たす可能性がある4。したがって、脳オルガノイドを用いた神経発達におけるミトコンドリア欠損の影響を解明することは、これらの疾患の研究にも役立つかもしれない。本論文では、ミトコンドリア病の疾患モデル化に使用できる再現性脳オルガノイドを生成するための詳細なプロトコルについて説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、ヒトiPSC由来の脳オルガノイドの再現性のある生成と、ミトコンドリア病のモデル化に用いることを説明する。ここで説明するプロトコルは、以前に公開された work20 に基づいて変更されます。本プロトコルの大きな利点の1つは、各オルガノイドを足場マトリックスに手動で埋め込む必要がなされないことである。実際、マトリックス溶液は、細胞培養培地に単…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ミリアム・ビュニングの技術サポートに感謝します。我々は、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG)(PR1527/5-1からA.P.)、スパークとベルリン衛生研究所(BIH)(BIH検証資金からA.P.)、ユナイテッド・水戸からの支援を認める コンドリア病財団(UMDF)(リー症候群国際コンソーシアム補助金A.P.)、大学病院デュッセルドルフ(Forschungskommission UKDからA.P.)、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)(e:バイオ若手研究者は、AZ 031L0211をA.P.に付与します。C.R.R.の研究室での作業は、DFG(FOR 2795 「ストレス下のシナプス」、Ro 2327/13-1)によってサポートされました。
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
| Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
| Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
| Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
| Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Sodium chloride | Roth | 3957 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
Riferimenti
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