Il rilevamento delle interazioni patogeno ospite-batterico basate sull'aderenza fenotipica utilizzando l'imaging di etichettatura a fluorescenza ad alto rendimento insieme a metodi di analisi statistica automatizzati consente una rapida valutazione delle potenziali interazioni batteriche con le cellule ospiti.
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Articolo metodologico
Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti
In questo articolo
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Sommario
Abstract
L'identificazione di patogeni batterici emergenti è fondamentale per la salute e la sicurezza umana. L'aderenza batterica alle cellule ospiti è un passo essenziale nelle infezioni batteriche e costituisce un segno distintivo di potenziale minaccia. Pertanto, l'esame dell'aderenza dei batteri alle cellule ospiti può essere utilizzato come componente della valutazione della minaccia batterica. Un metodo standard per enumerare l'aderenza batterica alle cellule ospiti è quello di co-incubare i batteri con le cellule ospiti, raccogliere i batteri aderenti, placcare le cellule raccolte su mezzi solidi e quindi contare le unità formanti colonie risultanti (CFU). In alternativa, l'aderenza batterica alle cellule ospiti può essere valutata utilizzando approcci basati sulla microscopia a immunofluorescenza. Tuttavia, le strategie convenzionali per l'attuazione di questi approcci richiedono molto tempo e sono inefficienti. Qui viene descritto un metodo di imaging automatizzato basato sulla microscopia a fluorescenza sviluppato di recente. Se combinato con l'elaborazione delle immagini ad alto rendimento e l'analisi statistica, il metodo consente una rapida quantificazione dei batteri che aderiscono alle cellule ospiti. Due specie batteriche, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa e Gram-positive Listeria monocytogenes e corrispondenti controlli negativi, sono state testate per dimostrare il protocollo. I risultati mostrano che questo approccio enumera rapidamente e accuratamente i batteri aderenti e riduce significativamente i carichi di lavoro e le tempistiche sperimentali.
Introduzione
L'adesione batterica è un processo in cui i batteri si attaccano ad altre cellule o superfici. L'instaurazione di successo dell'infezione da parte di agenti patogeni batterici richiede l'adesione alle cellule ospiti, la colonizzazione dei tessuti e, in alcuni casi, l'invasione delle cellule ospiti1,2,3. Le malattie infettive emergenti costituiscono gravi minacce per la salute pubblica, come evidenziato dalla recente pandemia di COVID-194,5,6. È importante sottolineare che i patogeni ....
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Protocollo
1. Coltura cellulare A549
- Mantenere la linea cellulare A549 in mezzo F-12K integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e incubare a 37 °C, 5% CO2.
- Cambiare il mezzo ogni 3-4 giorni e passare all'85% -95% di confluenza.
- Brevemente, sciacquare le cellule con 1 x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4, se non diversamente indicato) e trattare con 1 ml di 0,25% di tripsina-0,53 mM soluzione di acido etilendiamminatetraacetico (EDTA) (immergendo lo strato cellulare) per circa 2 minuti a 37 °C.
- Aggiungere ulteriori 6 mL di terreno di crescita completo (F-12K medio + 10% FBS) per interrompere l'attività della....
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Risultati
Per sviluppare il test di aderenza batterica basato sull'imaging a fluorescenza, P. aeruginosa ceppo PAO1 e la sua controparte ad aderenza negativa E. coli sono stati utilizzati per testare l'efficacia del protocollo, poiché l'aderenza di questi batteri alle cellule A549 era stata riportata14,20,22. In primo luogo, P. aeruginosa (PAO1) marcata GFP e E. coli marcata GFP sono state co-incubate c.......
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Discussione
Il protocollo descrive un approccio automatizzato per enumerare l'attaccamento batterico alle cellule ospiti. L'approccio descritto presenta diversi vantaggi interessanti rispetto ai metodi convenzionali. In primo luogo, questo approccio consente la quantificazione precisa del numero di cellule patogene microbiche che sono attaccate alle singole cellule ospiti. È importante sottolineare che questa quantificazione può essere eseguita senza la necessità di laboriose raccolte batteriche, diluizioni seriali, placcatura su me.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Siamo grati al Dr. Kaite Zlotkowski di Biotek Inc. per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal Dipartimento della Difesa con il numero di contratto W911NF1920013 a PdF, dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dal Dipartimento degli Interni con contratto n. 140D6319C0029 a PdF. Il contenuto delle informazioni non riflette necessariamente la posizione o la politica del governo e non dovrebbe essere dedotto alcun avallo ufficiale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Colorante per colorazione di cellule ospiti |
| Piastra a 96 pozzetti | Corning | 3882 | Pozzetto a mezza area, fondo piatto e trasparente |
| A549 celle | ATCC | CCL 185 | Linea cellulare di mammifero |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Colorante antibatterico |
| Centrifuga | Eppendorf | 5810R | |
| Tracker di divisione cellulare CFSE | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek Cytation 5 | Lettore multimodale per imaging cellulare | |
| E. coli | Scorte da laboratorio | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | Terreno per colture cellulari HUVEC |
| EHEC | Collezioni NIST | ||
| F-12k Terreno | ATCC | 302004 | A549 terreno di coltura cellulare |
| Siero fetale bovino | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Stock da laboratorio | ||
| L. monocytogenes | Collezioni NIST | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows stock di laboratorio | ||
| P. aeruginosa & Delta; pilA | Dr. Lori Burrows stock di laboratorio | ||
| S. agalactiae | Collezioni NIST | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus & Delta; saeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | Collezioni NIST | ||
| Brodo di soia tipico | Growcells | MBPE-4040 |
Riferimenti
- Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
- Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 2/08/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine
