הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד
Summary
כתב יד זה מתאר את שיטת הכתם וצלילה להקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד.
Abstract
הדמיית דגימות ביולוגיות עם אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד (cryoEM) דורשת שכבה דקה של קרח זגוגי המכיל את הביומולקולים של עניין. למרות התפתחויות טכנולוגיות רבות בשנים האחרונות שדחפו את CryoEM של חלקיק יחיד לחזית הביולוגיה המבנית, השיטות שבאמצעותן דגימות מתחדשות להדמיה ברזולוציה גבוהה נשארות לעתים קרובות הצעד המגביל את הקצב. למרות שמאמצים רבים שנעשו לאחרונה סיפקו אמצעים להתגבר על משוכות שנתקלו בהן לעתים קרובות במהלך vitrification דגימה, כולל פיתוח של תמיכה מדגם חדשני ומכשור ויטרציה חדשני, הבוכנה המסורתית המופעלת ידנית נשארה מרכיב עיקרי בקהילת cryoEM בשל העלות הנמוכה לרכישה וקלות הפעולה. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות לשימוש במכשיר סטנדרטי בסגנון גיליוטינה המופעל באופן ידני כתם וצלילה להתחדשות של דגימות ביולוגיות להדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי קריום חלקיק יחיד. בנוסף, בדרך כלל נתקל בבעיות והמלצות פתרון בעיות כאשר הכנה סטנדרטית נכשלת להניב דגימה מתאימה מתוארים גם.
Introduction
מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד (cryoEM) היא טכניקה מבנית רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לפתור מבנים של דגימות ביולוגיות דינמיות לרזולוציה כמעט אטומית1,2,3,4. ואכן, ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות גלאי אלקטרונים ישיר4,5,6,7,8,9,10, שיפורים במקורות אלקטרונים4,11,12,13,14 ויציבות עדשה אלקטרומגנטית15, יחד עם המשך הפיתוח של רכישת נתונים 16,17 וחבילות תוכנה לניתוח18,19, אפשרו לחוקרים לקבוע כעת באופן שגרתי מבנים של דגימות מחונכות היטב ל-3 רזולוציה של Å או טוב יותר4,11,13,14,20,21,22,23 . למרות יכולות הדמיה ועיבוד נתונים משופרות אלה, הכנת רשת CryoEM נותרה המכשול הגדול ביותר לקביעת מבנה מוצלח ברזולוציה גבוהה ולעתים קרובות משמשת צוואר בקבוק ניכר בזרימת העבודה EM24,25,26,27.
CryoEM מסתמכת על הדמיה של דגימות ביולוגיות בפתרונות מימיים שהוקפאו כדי ליצור סרט דק של קרח “דמוי זכוכית” – תהליך המכונה vitrification – המשמר את המצב הביוכימי המקומי. Vitrification של דגימות ביולוגיות עבור cryoEM שתחילתה מעל 40 שנים28,29,30 וטכניקות וציוד רבים שפותחו עבור תהליך זה מסתמכים על שיטת blot-and-plunge המפורטת במקור31,32,33,34,35 לפיו נפח קטן של מדגם (למשל, 1-5 μL) מוחל על רשת EM מיוחדת לפני הפתרון העודף מוסר באמצעות אינטראקציה פיזית של הרשת עם נייר סופג., התזמון של תהליך זה נקבע בדרך כלל אמפירית עבור כל דגימה כמרכיב קריטי של הקפאת דגימות הוא עובי סרט הקרח הזגג – אם הקרח סמיך מדי אז איכות ההדמיה מתדרדרת באופן דרמטי עקב פיזור מוגבר של קרן האלקטרונים בעוד קרח דק מדי יכול להגביל את אוריינטציות החלבון ו / או להוציא חלקיקים ממרכז חורי רדיד הרשת36 . הסתמכות זו על עובי הקרח המושלם עבור CryoEM חלקיק יחיד הובילה למגוון רחב של טכניקות וציוד שיכולים להקפיא דגימות, כולל רובוטיקה37,38, microfluidics42, והתקנים קוליים או ריסוס27,39,40,41,42,43,44 . בשנים האחרונות, חלק ממכשירי הכנת הדגימה הפופולריים ביותר מסתמכים על שימוש ברובוטיקה להקפאה אוטומטית של דגימות בטכניקת הכתם והצללה45. בעוד מכשירים אלה נועדו ליצור עובי קרח מתאים להדמיה, לעתים קרובות הם נשארים יקרים מדי עבור מעבדות בודדות לרכוש ולתפעול והם נמצאים בדרך כלל בתוך מתקני cryoEM בתעריפים לשעה לשימוש. בשנים האחרונות, טכניקת הכתם וצלילה הידנית המקורית חזרה לשימוש מוגבר3,47,48,49,50,51,52. ואכן, מכשיר כתם וצלילה המופעל באופן ידני יכול להשיג רשתות קריום באיכות גבוהה בשבריר מהעלות של עמיתים רובוטיים. יתר על כן, סופג ידני גם מציע למשתמשים יותר שליטה על סופג כמו חוקרים יכולים להתאים את סוג של blotting (כלומר, back-blotting של הרשת, החלקה קדמית של הרשת, וכו ‘), וזמן סופג בהתבסס על כל מדגם בודד ושאלות מחקר.
במאמר זה, אנו מספקים פרטים על איך להקפיא ביעילות דגימות ביולוגיות באמצעות מכשיר vitrification כתם וצלילה ידני מסורתי בשילוב עם פלטפורמת dewar מעוצבת בהתאמה אישית53. שיטות עבודה מומלצות, כולל הכנת קריוגן, טיפול ברשת, יישום מדגם, סופג, כמו גם מלכודות נפוצות והמלצות על איך להתגבר על משוכות אלה מסופקים. עצה כיצד להגדיל את עובי הקרח רבייה בין תכשירי רשת וכיצד לשנות כתמי מדגם בהתבסס על סוג הדגימה הביולוגית נדונים. בהתחשב בעלות הנמוכה הקשורה לרכישה ותפעול של הבוכנה הידנית המתוארת בכתב יד זה, מעבדות ברחבי העולם יכולות להכין דגימות ביולוגיות עבור cryoEM באופן חסכוני וניתן לשחזור.
Protocol
Representative Results
Discussion
vitrification של דגימות ביולוגיות להדמיה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית חלקיק יחיד (cryoEM) נשאר צעד חשוב מאוד לקביעת מבנה מוצלחת. שיטת הכתם והצלילה הידנית המתוארת בפרוטוקול זה מייצגת שיטה חסכונית, אמינה וחזקה להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות בסרטים דקים של קרח שרץ להדמיית cryoEM. באמצעות הש?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת הרציק על החשיבה הביקורתית ומתן משוב על כתב יד זה ותוכן הווידאו. M.A.H.Jr נתמך על ידי NIH R35 GM138206 וכמלומד סירל. H.P.M.N נתמך על ידי מענק אימון ביופיסיקה מולקולרית (NIH T32 GM008326). ברצוננו גם להודות לביל אנדרסון, צ’ארלס באומן וד”ר גבריאל לנדר במכון המחקר סקריפס על העזרה בתכנון, הרכבה ובדיקה של הבוכנה הידנית המוצגת בסרטון.
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
Riferimenti
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).
